[發明專利]白細胞介素2-白細胞介素6-白細胞介素23三聚體蛋白及其應用

無效

• 申請號: 200710173232.7
• 申請日: 2007-12-26
• 公開（公告）號: CN101469018A
• 公開（公告）日: 2009-07-01
• 發明（設計）人: 李峰
• 申請（專利權）人: 上海匯康生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/55
• 分類號: C07K14/55;C07K14/54;C12N15/26;C12N15/24;C12N15/85;A61K38/20;A61P37/02;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種白細胞介素2(IL-2)—白細胞介素6(IL-6)—白細胞介素23(IL-23)三聚體蛋白，提供一種生物技術來制備該三聚體蛋白，本發明的另一目的是提供IL-2-IL-6-IL-23三聚體蛋白在高效抗腫瘤方面的應用。

背景技術

以往研究表明：IL-2是由T細胞分泌的一種細胞因子，具有廣泛的免疫活性，臨床應用可使30％的淋巴瘤、腎癌、黑色素瘤病員有效。對結腸癌及非何杰金氏淋巴病也有較好療效，而且能夠增強免疫力。IL-6是一具有明顯抗腫瘤活性的生物免疫調節劑，屬參與造血、免疫的多功能因子，其特點是抗腫瘤活性高，毒性作用小。新近研究證實，IL-6可直接作用于NK細胞，并促進其功能分化。IL-23是由p19和IL-12的p40亞單位通過二硫鍵相連組成的異二聚體。由活化的樹突狀細胞(DC)和巨噬細胞()產生，它能促進DC對腫瘤抗原肽的提呈，能影響T細胞的增殖，并且除了直接作用于T細胞外，IL-23還能通過DC來活化和調節T細胞依賴的免疫應答。最重要的是，IL-23具有較強的抗腫瘤作用，其對APC有明顯激活作用。

發明內容

本發明目的是提供一種IL-2-IL-6-IL-23三聚體蛋白，提供一種生物技術制備IL-2-IL-6-IL-23三聚體蛋白的方法。本發明的另一目的是提供一種IL-2-IL-6-IL-23三聚體蛋白在高效抗腫瘤方面的應用。

本發明的目的是通過下述方法實現的：我們以IL-2功能區特異性的上下游引物，通過RT-PCR合成包含信號肽序列及HindHI-Kpn?I兩個酶切位點的IL-2cDNA，以IL-6功能區特異性的上下游引物合成包含BamHI-EcoRI兩個酶切位點的IL-6cDNA。以IL-23功能區特異性的上下游引物合成包含XhoI-XbaI兩個酶切位點及終止密碼子TGA的IL-23cDNA。經過純化酶切，分別連接重組至表達載體pcDNA3.1(+)。將該pcDNA3.1(+)/IL-2-IL-6-IL-23重組質粒轉染至中國倉鼠卵巢細胞(CHO)進行表達，表達產物即為IL-2-IL-6-IL-23三聚體蛋白。

IL-2-IL-6-IL-23三聚體蛋白三種細胞因子有較好的協同效應，其抗腫瘤作用顯著增強。

具體實施方式

以下對本發明作詳細說明：

一、引物合成：利用Sequce程序通過計算機分析確定轉譯的最佳起始區域，使其具有最小自由能，最佳堿基排列，確保兩個引物之間，引物與模板之間具有最少的配對以避免擴增不必要的序列。在IL-2上游引物中導入HindIII酶切位點，接著為起始密碼子ATG及信號肽序列；在下游引物中導入Kpn?I酶切位點。在IL-6上游引物中導入BamHI酶切位點，下游引物中導入EcoRI酶切位點。在IL-23上游引物中導入XhoI酶切位點；下游引物中導入終止密碼子TGA及XbaI酶切位點。

二、基因克隆：通過RT-PCR合成包含信號肽序列及HindIII-Kpn?I兩個酶切位點的IL-2cDNA；無信號肽序列的包含BamHI-EcoRI兩個酶切位點的IL-6cDNA及有終止密碼子TGA的包含XhoI-XbaI兩個酶切位點的IL-23cDNA。經過純化，再以T-A克隆進行擴增，最后將該IL-2cDNA、IL-6cDNA與IL-23cDNA分別克隆入pcDNA3.1(+)表達載體，以HindIII-Kpn?I、BamHI-EcoRI及XhoI-XbaI雙酶切鑒定及測序分析。

三、真核細胞表達：將上述陽性克隆轉染CHO細胞表達，收集表達上清，以ELISA檢測IL-2、IL-6和IL-23蛋白的表達。

四、純化及活性鑒定：對表達上清進行蛋白純化，純化后的蛋白進行淋巴細胞增殖試驗，證實該表達產物可明顯增強淋巴細胞增殖，且比單獨的IL-2、IL-6及IL-23效果更為明顯。

該發明所獲得的IL-2-IL-6-IL-23三聚體蛋白有明顯的協同效應，其抗腫瘤效果顯著增強，且制備方法簡單。