[發(fā)明專利]利用A3啟動子缺陷piggyBac轉座子創(chuàng)制轉基因家蠶方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710164477.3
• 申請日: 2007-12-05
• 公開（公告）號: CN101177692A
• 公開（公告）日: 2008-05-14
• 發(fā)明（設計）人: 楊惠娟;鐘伯雄;陸長德;莊蘭芳;范偉;蘭天云;丁農(nóng)
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;C12N15/85;A01K67/04
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司
• 代理人: 林懷禹

技術領域

本發(fā)明涉及一種利用A3啟動子缺陷piggyBac轉座子創(chuàng)制轉基因家蠶方法。

背景技術

家蠶是重要的模式昆蟲，其基因組測序的完成為在基因水平開展研究提供了基礎。piggyBac轉座子介導的轉基因家蠶研究技術的日漸成熟更是為家蠶的基因研究開辟了更為廣闊的研究空間。Tamura等構建的帶有A3啟動子并以EGFP為標記基因的piggyBac轉座子已能成功的在家蠶轉入和表達。Zhong等的研究表明對于不同品種的家蠶其轉入效率也有不同，Nistari品系具有較高的轉導率。啟動子缺陷轉基因系統(tǒng)對于篩選組織特異性啟動子和研究基因的表達調控具有重要的意義，但在家蠶研究中還沒有啟動子缺陷的轉座子，也沒有利用啟動子缺陷轉基因系統(tǒng)篩選組織特異性啟動子及研究基因功能的報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種利用A3啟動子缺陷piggyBac轉座子創(chuàng)制轉基因家蠶方法，是先切除帶有熒光標志基因的piggyBac轉座子中A3啟動子，利用轉基因技術將這種啟動子缺陷轉座子插入家蠶功能基因的啟動子后面，借助功能基因啟動子的作用表達熒光標志基因，創(chuàng)制成一種轉基因家蠶，這種轉基因家蠶能夠用于組織特異性表達啟動子的篩選和基因功能研究，達到育成具有特異性功能家蠶新品種。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用的技術方案的步驟如下：

(1)采用BglII和BamHI雙酶切，切去帶有熒光標志基因的piggyBac質粒中長度為853bp的A3啟動子，回收大片段7124bp，自連接得到A3啟動子缺陷的piggyBac質粒；

(2)采用蠶卵顯微注射轉基因方法，導入A3啟動子缺陷的piggyBac質粒及其能夠提供轉座酶的輔助質粒，在G0代或G0以后代蟻蠶時期，通過選擇熒光標志基因獲得轉基因家蠶，飼養(yǎng)至成蟲交配續(xù)代；

(3)育成能夠用于組織特異性表達啟動子的篩選和基因功能研究的轉基因家蠶。

所述的熒光標志基因是指含有GFP、EGFP、RFP、CFP或YFP熒光標志基因。

所述的蠶卵顯微注射的時間是產(chǎn)卵后8小時以內(nèi)，piggyBac質粒及其能夠提供轉座酶的輔助質粒的比率在10∶1-1∶2之間，這2種質粒的總濃度在0.1μg/μl-2μg/μl，質粒溶解在0.1mM-2mM含有1mM-8mM氯化鈉的磷酸緩沖液中。

本發(fā)明具有的有益效果是：

可以借助熒光標志基因篩選轉基因家蠶個體，這種轉基因家蠶能夠用于組織特異性表達啟動子的篩選和基因功能研究，達到育成具有特異性功能家蠶新品種。

附圖說明

圖1是A3啟動子缺陷轉座質粒構建示意圖。

圖2是能夠提供轉座酶的輔助質粒。

圖3是A3啟動子缺陷轉座質粒的酶切鑒定電泳圖。

圖4是G1代近尾足部組織特異性表達GFP的轉基因家蠶。

圖5是G1代胸部組織特異性表達EGFP的轉基因家蠶。

圖6是G1代尾部組織特異性表達EGFP的轉基因家蠶。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1：

根據(jù)pPIGA3GFP(7977bp)質粒圖譜，用BglII和BamHI雙酶切，切去長度為853bp的A3啟動子，回收大片段7124bp，自連接得到如圖1所示的A3啟動子缺陷的帶有GFP熒光標志基因的piggyBac質粒，圖中，A表示的是攜帶A3啟動子的質粒；B表示的是去掉A3啟動子的質粒；完成后分別用Pst?I，EcoR?I+Hpa?I和Bgl?II+BamH?I酶切鑒定重組質粒，A3啟動子被完全切去，產(chǎn)物與質粒結構相符合(如圖3所示)，且經(jīng)改造的質粒缺失了Bgl?II+BamH?I酶切位點(如圖3所示，泳道3)。

圖3中，泳道1-3表示的是pPIGGFP質粒：其中，泳道1，Pst?I酶切；泳道2，EcoR?I+Hpa?I酶切；泳道3，Bgl?II+BamH?I酶切。泳道4-6表示的是pPIGA3GFP質粒：其中，泳道4，Pst?I酶切；泳道5，EcoR?I+Hpa?I酶切；泳道6，Bgl?II+BamH?I酶切。Marker為分子標記，單位為bp，從上而下的條帶為：10000，7500，5000，2500，1000，250。