[發(fā)明專利]用于細(xì)胞培養(yǎng)的經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)包被的表面

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710159634.1
• 申請日: 2007-05-16
• 公開（公告）號: CN101182464A
• 公開（公告）日: 2008-05-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: S·X·錢;S·桑揚(yáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 貝克頓·迪金森公司
• 主分類號: C12M3/04
• 分類號: C12M3/04;C12N5/06;C12N5/08
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進(jìn)委員會(huì)專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 羅菊華

對相關(guān)申請的交叉引用

[0001]本申請要求2006年5月16日提交的美國臨時(shí)申請第60/747,349號、2006年6月30日提交的美國臨時(shí)申請第60/817,942號、2006年6月30日提交的美國臨時(shí)申請第60/817,736號、2007年1月2日提交的美國臨時(shí)申請第60/883,083號和2007年1月29日提交的美國臨時(shí)申請第60/886,984號的利益，上述申請的內(nèi)容全部引入此處作為參考。

技術(shù)領(lǐng)域

[0002]本發(fā)明一般涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，更具體而言，本發(fā)明涉及一種適合培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)組合物包被的基底(substrate)。

背景技術(shù)

[0003]胚胎干細(xì)胞的特征是具有高端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性、無限自我更新能力和多潛能(分化成三個(gè)胚層，即，外胚層、內(nèi)胚層和中胚層，中的任何細(xì)胞類型的能力)的細(xì)胞。因此，對于人胚胎干(hES)細(xì)胞在基因/細(xì)胞治療和再生醫(yī)藥領(lǐng)域的潛在應(yīng)用，存在極大的希望。

[0004]人胚胎干(hES)細(xì)胞的首例成功衍生見Thomson，J.A.等的報(bào)道(Science(1998)282：1145-1147)。在那項(xiàng)研究中，hES細(xì)胞從胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離出來，接種在有絲分裂滅活的鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)細(xì)胞上。最初的hES細(xì)胞衍生和培養(yǎng)起源于在過去的25年中主要針對鼠ES(mES)細(xì)胞研發(fā)的培養(yǎng)實(shí)踐。雖然MEF飼養(yǎng)層被證明是一種對于hES細(xì)胞長期培養(yǎng)很有效的表面，但是這種方法有些局限性。首先，存在對可能轉(zhuǎn)移到hES細(xì)胞的潛在動(dòng)物病原體的擔(dān)心，這使得它們不適合臨床應(yīng)用。第二，生長和維持兩種細(xì)胞類型既不方便又很繁重。而且，在飼養(yǎng)層上轉(zhuǎn)染和遺傳操作致密的hES細(xì)胞集落是很困難的。基于所有這些原因，已經(jīng)開始為培養(yǎng)hES細(xì)胞嘗試發(fā)展無飼養(yǎng)層的條件。

[0005]小鼠ES細(xì)胞研究已經(jīng)為我們進(jìn)一步理解hES細(xì)胞的自我更新調(diào)節(jié)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。對特定的信號調(diào)節(jié)物的操作促進(jìn)了未分化hES細(xì)胞增殖所需要的無飼養(yǎng)層條件的開發(fā)。最近的研究清楚地描繪出hES細(xì)胞能在沒有飼養(yǎng)層的條件下生長，只要將它們種在適宜的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)上，并且在于飼養(yǎng)細(xì)胞上得到的條件培養(yǎng)基中或在補(bǔ)充可溶因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)即可。

[0006]細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是一種組成多變的三維分子復(fù)合物，可以包括諸如層粘連蛋白、纖連蛋白、膠原蛋白和其他糖蛋白、透明質(zhì)酸、蛋白聚糖和彈性蛋白等成分。市售的細(xì)胞外基質(zhì)的例子包括，例如Sigma-Aldrich的ECM凝膠或Becton，Dickinson?&?Company的Matrigel^TM基質(zhì)。Matrigel^TM基質(zhì)是一種從小鼠Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)腫瘤上分離的重建的基底膜。Matrigel^TM基質(zhì)主要是由層粘連蛋白、膠原蛋白IV、巢蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖組成的。Matrigel^TM基質(zhì)也包含大量的生長因子，例如EGF、IGF-1、PDGF、TGF-β、VEGF和bFGF。

[0007]本發(fā)明以前，眾所周知的是在ECM表面上使用來自不同類型的飼養(yǎng)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，hES細(xì)胞可以在未分化狀態(tài)增殖。使用ECM作為無飼養(yǎng)層基底培養(yǎng)hES細(xì)胞有許多優(yōu)點(diǎn)。例如，在ECM表面分離DNA、RNA和蛋白由于沒有來自飼養(yǎng)細(xì)胞的潛在污染而更加容易。此外，hES細(xì)胞的遺傳操作需要有效的轉(zhuǎn)染能力。生長在Matrigel表面的hES細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率相比較生長在飼養(yǎng)細(xì)胞上的要高。當(dāng)在BD?Matrigel^TM基質(zhì)上培養(yǎng)時(shí)，早已證明hES細(xì)胞形成″單層樣″集落，這使得細(xì)胞個(gè)體更易接近以被DNA或SiRNA滲透。雖然其他ECM蛋白也成功地用于無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)，幾項(xiàng)先前的研究表明，為了和Matrigel^TM具有一樣好的性能，需要ECM蛋白的組合。此外，純化蛋白一般更加昂貴，不能象Matrigel^TM那樣作長期性能檢測。