[發明專利]棘皮動物活體取樣提取DNA的方法

無效

• 申請號: 200710157999.0
• 申請日: 2007-11-08
• 公開（公告）號: CN101168760A
• 公開（公告）日: 2008-04-30
• 發明（設計）人: 馮志綱;于佳平;丁君;田燚;常亞青
• 申請（專利權）人: 大連水產學院
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C12Q1/68;C07H21/04
• 代理公司: 大連非凡專利事務所
• 代理人: 閃紅霞

1.一種棘皮動物活體取樣提取DNA的方法，其步驟如下：

a.取棘皮動物活體組織至少0.01g，放入離心管中；

b.在盛有棘皮動物樣品組織的離心管中，加入200μl裂解液，然后將組織在裂解液中充分剪碎，50℃消化45～55min，期間每隔10min振蕩搖勻一次，所述裂解液的組分及終濃度為0.2g/l蛋白酶K，0.5％SDS，100mmol/l?EDTA，0.05g/lRNA酶；

c.在離心管中加入200μl?TES稀釋溶液稀釋；

d.加入200μl的Tris-飽和平衡酚和200μl氯仿-異戊醇混合液，萃取15～30min；

e.7500r/min離心10min，用粗口槍頭移液器抽取上清，將上清液置入另一離心管中；

f.重復d、e步驟；

g.將萃取之后的上清夜在10000r/min離心10min，使用粗口槍頭移液器吸取溶液，放入另一離心管中；

h.在離心管中，加入兩倍于離心管中體積的100％的-20℃乙醇，之后放入-20℃中靜置至少4h；

i.12500r/min離心15min，除去溶液，將離心管倒置在濾紙上，吸干剩液；

j.向離心管中加入70％乙醇800μl，洗滌一次，12500r/min離心5min，倒掉溶液，室溫晾干至少30min；

k.加入0.1×TE?100μl，輕輕振蕩，然后4℃溶解至少4h；

l.用1％的瓊脂糖凝膠電泳，取2μl?DNA模板混合2μl上樣緩沖液在瓊脂糖膠上點樣進行檢測。

2.根據權利要求1所述的棘皮動物活體取樣提取DNA的方法，其特征在于：所述a步驟是將活海膽或活海參放在盛有海水的容器中，海水的深度剛沒過海膽或海參，用剪刀剪取海膽管足或海參的觸手、管足，放在濾紙上吸干水分。

3.根據權利要求2所述的棘皮動物活體取樣提取DNA的方法，其特征在于：在所述海水中以0.001g/l的劑量加入青霉素。

4.根據權利要求1所述的棘皮動物活體取樣提取DNA的方法，其特征在于：所述a步驟是促使活海參排出內臟；將海參吐出的腸剖開用雙蒸水沖洗干凈，然后將洗凈的海參腸放在濾紙上吸干水分。

5.根據權利要求4所述的棘皮動物活體取樣提取DNA的方法，其特征在于：所述的促使活海參排出內臟是向海參體內注射淡水或注射0.35mol/l的KCl2～4ml。

6.根據權利要求1或2或3或4或5所述的棘皮動物活體取樣提取DNA的方法，其特征在于：所述f步驟后觀察中間層和下層，如有中間層或下層顏色深，加入400μl氯仿-異戊醇再萃取一次。