[發明專利]大腸菌群復合快速顯色診檢試劑及其研發工藝流程

無效

• 申請號: 200710157163.0
• 申請日: 2007-12-05
• 公開（公告）號: CN101294190A
• 公開（公告）日: 2008-10-29
• 發明（設計）人: 姚毓才
• 申請（專利權）人: 姚毓才
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;G01N21/78
• 代理公司: 杭州賽科專利代理事務所
• 代理人: 陳輝

技術領域

本發明涉及食品安全快速診檢試劑，具體涉及一種大腸菌群復合快速顯色診檢試劑及其研發工藝流程。

背景技術

由德國科學家科赫所創立的微生物純培養方法因其費用低廉、靈敏度高，能夠對微生物進行定性、定量的特異鑒定，因此時至今日仍為世界微生物學界所普遍接受為甄別微生物的權威方法。但純培養的缺點也十分明顯，從制備培養基、培養微生物、直到形成肉眼可辨的生長特征以及對微生物進行確證其種屬特征的生理生化指標的檢測，這一系列過程不僅浪費資源，耗時超長，且由于人員對儀器的操作使用以及操作手法的異同都可能造成結果的誤判，因此開發一項既能快速準確的鑒別微生物的種屬特性、又可以降低成本、同時減少檢測遲滯的微生物快速診檢試劑早已經成為國內外微生物檢測領域科研人員的迫切愿望，而今各種快速檢測試劑盒、紙片、旋轉平板法等皿膜法，電阻抗法，生物熒光法，免疫學法，基因探針，分子雜交，基因芯片方法等等層出不窮。但縱觀國內外快速診檢技術領域的發展情態，可以看出，無論是傳統的以純培養方法為主的檢測技術，還是實時檢測技術，國外都已經有了比較成熟的發展模式，以美國的3M、BD公司和法國的科瑪嘉、梅里埃公司為代表的一批企業，在快速診檢技術領域的探索方面已經走在了世界的前列。

但是從這類公司購買快速檢測試劑價格昂貴，應用成本過高，我國難以承受普及型應用，僅一些科研院所、高校、及有實力的大型企業可以嘗試，普通中小型企業、工商業者難以接受，而結合儀器進行實時檢測的方法國內落后的步伐更大，購買一臺普通的快速檢測設備動輒幾十萬美金。

發明內容

為了克服上述缺陷，本發明的目的是提供一種滿足食品藥品安全快速顯色診檢試劑。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

大腸菌群復合快速顯色診檢試劑研發工藝流程：

1、首先通過大腸菌群、質控菌株(沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌)的活化及生化鑒定確定質控手段；

2、根據目的菌株的需要篩選基本營養成分；

3、通過生長譜法驗證：微生物的生長繁殖需要適宜的營養環境，碳源、氮源、礦物質、微量元素、生長因子等等都為微生物生長所必需，缺少其中任意一種，微生物就不能正常生長、代謝、繁殖；

5、顯示劑、掩蔽劑及增效劑的遴選；

6、復合遴選；

7、通過快速顯色培養基各項指標測試驗證試驗，其包括特異性試驗、靈敏度試驗、實際樣品檢驗、假陰性、假陽性菌株鑒定、穩定性試驗、可重復性試驗、競爭菌株及雜菌干擾試驗、檢出時間、檢出率的試驗驗證復合遴選配方的可行性；

8、通過因素水平正交組合試驗遴選出最適配方。

大腸菌群復合快速顯色診檢試劑，其快速顯色鑒別培養基各項成分的篩選配方為：

快速顯色鑒別培養基各項成分：

1、碳源

乳糖；

2、氮源

蛋白胨；

3、礦物質

氯化鈉、磷酸氫二鉀；

4、掩蔽劑(需遴選)

牛膽鹽、煌綠、龍膽紫、孔雀綠、十二烷基磺酸鈉；

5、指示劑(需遴選)

氯化三苯四氮唑、伊紅、玫紅酸、中性紅；

6、增效劑

溴甲酚紫、羧甲基纖維素鈉

外界條件對菌體生長的影響：

一、PH值：A＝600nm

由上表可以看出大腸菌群的最適PH值范圍在6.7～7.5。

當培養時長為12小時時PH值＝6.9時菌種啟動生長速度最快；

當培養時長為24小時時PH值＝7.3時大腸菌群菌體濃度最高。原因：

當培養基內PH值過低時大腸菌群乳糖操縱子容易受到信息反饋抑制，菌體能量供應不足，導致遲緩期增加，對數生長期延后并縮短；

當培養基內PH值過高時，菌體內源蛋白合成受到抑制，誘導酶與合成酶的合成受阻。

因此我們選擇PH＝6.9做為快速檢測試劑的理想PH值。

二、溫度為37℃

本發明的目的為快速顯色檢測大腸菌群，大腸菌群的的最適生長溫度為37℃，因此我們選定37℃為檢測溫度。

培養基主要成分對菌體生長的影響：

我們根據微生物的特異種屬特征，分別就快速顯色檢測試劑的顯色劑、掩蔽劑以及增效劑這三個主要方面進行針對性遴選：

1、選擇四種顯色劑進行配伍，進行靈敏度和準確度試驗并以生長譜法做為初篩根據；

2、選擇四種掩蔽劑進行配伍，以質控菌株為標準做雜菌干擾試驗；