[發明專利]粘性沙雷氏菌及其生物轉化DL－乳酸生產丙酮酸

有效

• 申請號: 200710156905.8
• 申請日: 2007-11-20
• 公開（公告）號: CN101182484A
• 公開（公告）日: 2008-05-21
• 發明（設計）人: 鄭裕國;賈立壯;沈寅初
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P7/50;C12R1/43
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司
• 代理人: 黃美娟;袁木棋

(一)技術領域

本發明涉及生物轉化DL-乳酸生產丙酮酸，特別是以粘性沙雷氏菌生物轉化DL-乳酸生產丙酮酸。

(二)技術背景

丙酮酸，是重要的α-氧代羧酸之一，為無色至淡黃色液體，呈醋酸香氣，易吸潮、聚合、分解，能與水、乙醇、乙醚等混溶。

丙酮酸(鹽)及其衍生物廣泛應用于制藥、日化、食品和農用化學品等行業。丙酮酸是酶法合成多種氨基酸和維生素的前體物質：制藥工業上可用于酶法合成L-色氨酸、合成L-半胱氨酸、L-多巴、L-亮氨酸，合成系列酶蛋白抑制劑、鎮靜劑、2-苯基喹啉-4-羧酸、磷酸烯醇丙酮酸、4-甲唑甲酸等，特別是丙酮酸鈣作為一種減肥藥品被開發后，目前丙酮酸的市場需求量很大；食品工業上可用作防腐保鮮劑；日化工業上，丙酮酸乙酯可抑制表皮中酪氨酸酶的形成美白皮膚，可用作化妝品的防腐劑和抗氧劑，用作空氣清新劑；農用化學方面，丙酮酸乙酯是合成乙烯聚合物、氫化阿托酸、谷物保護劑、成熟劑等多種農藥的起始原料；生化試劑和生物傳感器方面丙酮酸也有較廣泛的應用。因此，微生物轉化乳酸生產丙酮酸的研究有著重要意義。

國內外用微生物法轉化乳酸生產丙酮酸已有一些文獻報道，用于生產丙酮酸的微生物主要是遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella?tarda)(J.Ferment.Bioeng.81(1996)357-359)、普通變形桿菌(Proteus?vulgaris)(J.Biotechnol.31(1993)191-203)、奇異變形桿菌(Proteus?mirabils)(J.Biotechnol.31(1993)191-203)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus?saprophyticus)(Chin.J.Appl.Envi?ron.Biol.7(2001)617-620)、不動桿菌屬(Acinetobacter)(Biotechnol.Prog.19(2003)1672-1676)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)(Biochem.Eng.J.22(2005)89-96)和斯氏假單胞菌(Pseudomonas?stutzeri)(Biotechnol.Lett.29(2007)105-110)。

微生物轉化乳酸生產丙酮酸具有轉化率高、產物易分離、環境污染小等優點，符合綠色化學的發展方向；DL-乳酸和丙酮酸也有較大的差價，因此，微生物轉化DL-乳酸生產丙酮酸的研究有著重要的社會效益和經濟效益。

(三)發明內容

本發明的目的在于提供能轉化乳酸生產丙酮酸的粘性沙雷氏菌(Serratiamarcescens)ZJB-07166及其在制備丙酮酸中的應用。

本發明提供的粘性沙雷氏菌(Serratia?marcescens)ZJB-07166保藏于中國典型培養物保藏中心，其簡稱為CCTCC，保藏地址：中國武漢武漢大學生命科學學院，保藏編號CCTCC?No：M207140，保藏日期為2007年9月7日。

本發明所述粘性沙雷氏菌ZJB-07166由以下途徑篩選得到：

(1)富集培養基及條件：DL-乳酸鈉10g/L，磷酸二氫鉀1g/L，磷酸氫二鉀1g/L，氯化銨3g/L，用蒸餾水配制，pH7.0。培養條件：30℃，搖床轉速150r/min。5g土樣加入100mL富集培養基培養，培養48小時后，轉接1mL富集培養液至新的富集培養基培養。

(2)第二次富集培養液稀釋后涂布到平板培養基上，30℃培養箱恒溫培養24小時，挑取單菌落至斜面培養后保藏，斜面培養條件為30℃培養箱恒溫培養24小時。平板培養基及斜面培養基組分：DL-乳酸鈉10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，瓊脂15g/L-20g/L，pH7.0。

(3)挑取的單菌落接種到菌體培養基，培養36小時，離心收集菌體，用pH7.0，0.05M磷酸鈉緩沖液洗滌兩次后，離心收集菌體，所得菌體與底物DL-乳酸均勻分散于蒸餾水中，底物濃度50mM，30℃，150r/min水浴下反應12小時。轉化液通過液相檢測，能轉化DL-乳酸生成丙酮酸的菌株為目的菌株。所述菌體培養基組分：DL-乳酸鈉10g/L，磷酸二氫鉀1g/L，磷酸氫二鉀1g/L，氯化銨3g/L，用蒸餾水配制，pH7.0。

本發明中丙酮酸采用液相色譜的方法進行檢測，檢測條件為：C18反相色譜柱，流動相為0.005M硫酸溶液，流速為1mL/min，檢測波長215nm，進樣量20μL，柱溫：30℃。