[發明專利]一種確立參與卵巢癌腫瘤發生學的蛋白的研究方法

無效

• 申請號: 200710156211.4
• 申請日: 2007-09-30
• 公開（公告）號: CN101140261A
• 公開（公告）日: 2008-03-12
• 發明（設計）人: 錢建華;羅潔
• 申請（專利權）人: 浙江大學醫學院附屬婦產科醫院
• 主分類號: G01N27/64
• 分類號: G01N27/64;G01N33/48
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司
• 代理人: 周烽

技術領域

本發明涉及醫療評價、檢測技術領域，特別地，涉及一種確立參與卵巢癌腫瘤發生學的蛋白的研究方法。

背景技術

據美國2000年報道，約有80％的卵巢癌病人發現在中晚期，其五年生存率僅為35％。反之，在早期發現的病人中，則五年的生存率超過90％，其中許多病人僅通過外科手術便獲得治愈。因此，提高該病的早期診斷率，對于降低卵巢癌病人的死亡率和治療費用，具有直接地作用。應用新技術檢測卵巢癌，對于提高婦女健康水平具有重要作用。特別是對于卵巢癌高危人群，如有家族或個人腫瘤史、有腫瘤易感基因BRCA1和BRCA2突變的婦女更為急迫，但目前對于這部分人群尚無有效的篩查方法。因此需要尋找特異性更強和靈敏度更高的腫瘤分子標記物。目前最普遍使用的卵巢癌生物標記物是腫瘤抗原CA125，盡管80％的晚期卵巢癌病人CA125濃度不正常，但是僅有50-60％的早期卵巢癌病人CA125濃度增高。CA125單獨作為標記物的陽性預測值不到10％，加上超聲檢查，陽性預測值增加至20％。低分子量的血清蛋白質波譜可能反映組織的病理狀態，并有助于腫瘤早期檢測。生物質譜SELDI-TOF能夠獲得此范圍的蛋白質波譜。這些波譜包含上千個數據點。生物信息學已經用于研究生理學的結果和基因芯片，但是對于血清蛋白質的復雜質譜圖中未能分析出的變化，則需要更高等級的數據分析系統。利用SELDI-TOF蛋白質芯片系統，可分析病人血清蛋白質波譜變化，確立參與卵巢癌腫瘤發生學的蛋白，并且可用于腫瘤早期診斷。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種確立參與卵巢癌腫瘤發生學的蛋白的研究方法。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：一種確立參與卵巢腫瘤發生學的蛋白的研究方法：

(1)別取上皮性卵巢癌標本和交界性卵巢腫瘤標本；

(2)激光捕獲微切割：從同一上皮性卵巢癌標本中分離出癌細胞和相對正常細胞，從同一交界性卵巢腫瘤標本中分離出交界性腫瘤細胞和相對正常上皮細胞；

(3)細胞裂解：將步驟(2)中分離出的細胞分別置入細胞裂解液中，離心除去細胞碎片；

(4)應用表面加強激光解析電離化飛行時間質譜蛋白質芯片技術分析上皮性卵巢癌細胞和相對正常細胞、交界性卵巢腫瘤細胞和相對正常上皮細胞，尋找蛋白質譜的差異點；

(5)數據分析：將原始數據用平移不變小波變換，去除噪音，并減掉基線，分別用支持向量機方法建立判別模型，用留一法交叉驗證作為評估模型判別效果的方法，建立的模型和留一法交叉驗證的結果作為最終的結果。

本發明相對于現有技術，具有如下技術效果：

(1)本發明采用激光捕獲微切割技術和表面加強激光解析電離化飛行時間質譜蛋白質芯片技術，高精準、高通量、低豐度；

(2)該兩項技術的結合在腫瘤學包括婦科腫瘤學的研究中具有廣闊的應用前景，為研究者對卵巢癌的診斷、鑒別及治療提供了新的分子生物學證據。

附圖說明

圖1為本發明的方法流程圖。

具體實施方式

下面根據附圖和實施例詳細說明本發明，本發明的目的和效果將變得更加明顯。

本發明所提供的用于確立參與卵巢癌腫瘤發生學的蛋白的方法的步驟為：

1.獲取標本：取上皮性卵巢癌標本和交界性卵巢腫瘤標本，保存在冰箱待測(-70℃--80℃)。

2.激光捕獲微切割：從上皮性卵巢癌標本中分離出癌細胞和相對正常細胞，從交界性卵巢腫瘤標本中分離出交界性腫瘤細胞和相對正常上皮細胞；

(1)切片準備：冰凍組織包埋，5-8mm冰凍切片后貯存在冰箱待用(-70℃--80℃)；

(2)切割前，切片立刻解凍，70％酒精固定5s，蘇木素染色8s，蘇木素-伊紅染色，70％、95％、100％酒精脫水1.5m，每步脫水后二甲苯2m，然后空氣中風干。70％酒精和蘇木素中添加小型蛋白酶抑制劑。

(3)激光微切割：采用德國萊卡公司激光微切割機器。每次切割時間少于30m防止蛋白降解。～1×10⁴細胞數，貯存在冰箱待測(-70℃--80℃)。

3.細胞裂解：將微切割后的細胞分別置入6μL細胞裂解液中4℃20分鐘，后離心除去細胞碎片，貯存待用。