[發明專利]一種分離鑒定血液中有核紅細胞的方法

無效

• 申請號: 200710151966.5
• 申請日: 2007-09-24
• 公開（公告）號: CN101122601A
• 公開（公告）日: 2008-02-13
• 發明（設計）人: 孫艷萍
• 申請（專利權）人: 孫艷萍
• 主分類號: G01N33/49
• 分類號: G01N33/49;G01N1/30;G01N1/34;G01N21/25
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司
• 代理人: 張慧

1.一種分離鑒定血液中有核紅細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(一)配制試劑

(1)多聚賴氨酸工作液：多聚賴氨酸儲備液與雙蒸水1∶10充分混合，氣泡消失后備用；

(2)PH?7.4含0.5％BSA的0.01mol/L?PBS：

氯化鈉??????????6.5g

Na₂HPO₄·12H₂O??4g

NaH₂PO₄·2H₂O???0.35g

加雙蒸水800ml，調節PH值至7.4，雙蒸水補至1000ml，0.01mol/L?PBS，高壓滅菌后，加入5g?BSA，40℃保存；

(3)含KOH?200mmol/L，DTT?50mmol/L的堿性細胞裂解液：

400mmol/L?KOH??1ml

1mol/L?DTT?????100ul

滅菌注射用水850ul，充分混合，0.22μm微孔過濾器過濾后分裝，-20℃保存備用；

(二)制備防脫膠玻片

(1)載玻片的預處理

將普通載玻片用熱肥皂水洗刷，自來水清潔干凈，烘干，置于硫酸清潔液中浸泡24小時以上，自來水沖洗過夜，雙蒸水沖洗3遍，烘干，95％乙醇浸泡24小時，雙蒸水沖洗3遍，烤干，15磅高壓滅菌20min；

(2)多聚賴氨酸包被載玻片

將預處理后的玻片在多聚賴氨酸工作液中上下浸蘸10～20秒，分散架于玻片架上，60℃以下烘干，4℃保存備用；

(三)選擇有核紅細胞染色方法；

(四)顯微操作法獲取血液中有核紅細胞。

2.根據權利要求1所述的分離鑒定血液中有核紅細胞的方法，其特征在于，所述步驟(三)進一步包括以下步驟：

單密度梯度離心法收集有核血細胞：

①血液與等量含0.5％BSA的0.01mmol/L?PBS混勻，輕輕疊加于淋巴細胞分離液上，使兩者形成一個清晰的界面，1800r/min水平離心20min，吸取白膜狀的單個核細胞層，移至預先用PBS濕潤的潔凈玻璃離心管中；

②加入2倍以上0.5％BSA的0.01mmol/L?PBS洗滌細胞，1500r/min水平離心10min，棄上清，重復三次；

③用0.01mmol/L?PB?S稀釋細胞至適合濃度后涂片，自然干燥。

3.根據權利要求2所述的分離鑒定血液中有核紅細胞的方法，其特征在于，所述步驟(三)進一步包括以下步驟：

采用瑞氏-吉姆薩染色法對有核血細胞染色：

①玻片置于染片架上，滴加3～5滴瑞氏-吉姆薩復合染色液，使其迅速覆蓋標本1min；

②滴加緩沖液5～10滴，吸耳球對準玻片吹氣，使緩沖液與染液充分混合，染色5～10min；

③雙蒸水沖洗，晾干。

4.根據權利要求2所述的分離鑒定血液中有核紅細胞的方法，其特征在于，所述步驟(三)進一步包括以下步驟：

采用聯苯胺染色法對有核血細胞染色：

①玻片置于1％聯苯胺甲醇溶液中浸泡2min；

②往溶液中滴加10～20滴30％H₂O₂，使其與1％聯苯胺甲醇溶液之容積比為1∶50，混勻，玻片繼續浸泡1～2min；

③雙蒸水充分沖洗，晾干；

④蘇木素復染。

5.根據權利要求1-4中任意一項所述的分離鑒定血液中有核紅細胞的方法，其特征在于，所述步驟(四)進一步包括以下步驟：

①制備好的玻片放置于倒置相差顯微鏡下，400倍光鏡下觀察識別有核紅細胞并進行計數；

②在有核紅細胞周圍滴加10～20ul的0.25％蛋白酶K，使之從玻片上松懈，用顯微操作器單個吸取；

③將吸取到的細胞移至盛有2.5ul堿性細胞裂解液的PCR專用薄壁反應管中，離心后于-20℃低溫冰箱保存備檢。