[發(fā)明專利]BMP膠原框架法提取工藝

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710147551.0
• 申請日: 2007-08-27
• 公開（公告）號: CN101376672A
• 公開（公告）日: 2009-03-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王由;李永嵐;王維民
• 申請（專利權(quán)）人: 王由;李永嵐;王維民
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;C07K4/12
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• 代理人: 暫無信息

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone?morphogenetic?protein，BMP)基本按Urist方法在皮質(zhì)骨中提取的生物活性物質(zhì)。本發(fā)明：(1)本發(fā)明使BMP的提取工藝步驟簡化，不用加入有害的化學性物質(zhì)；(2)通過偏光顯微鏡觀察和測定分子量監(jiān)測BMP的提取過程。

一、技術(shù)領(lǐng)域

BMP是唯一能夠單獨誘導骨組織形成的局部骨生長因子，它在骨缺損修復中，其作用幾乎與自體骨的效果相似，在一定條件下，能誘導未分化的間充質(zhì)細胞向骨系細胞轉(zhuǎn)化，促進骨細胞的生長增殖。但由于BMP在骨組織中的含量很少(約1mg/kg濕骨)，且單獨使用在體內(nèi)很快擴散，容易被蛋白酶所分解吸收，因而不能在局部發(fā)揮持續(xù)刺激和誘導成骨的作用，其誘導活性難以得到充分的發(fā)揮。因此，BMP必須與載體交聯(lián)形成活性骨移植材料才能發(fā)揮其生理活性作用。

骨內(nèi)自身含有的BMP是一種非膠原蛋白，是骨明膠的降解產(chǎn)物。BMP平均分子量在18.5±0.5KD，有報導30KD區(qū)帶也有誘導活性，并發(fā)現(xiàn)誘導植入部位的間充質(zhì)細胞向成骨細胞方向轉(zhuǎn)化，從而加速骨的生長。一般認為BMP無種屬特異性，來源于人、猴、牛、鼠等的BMP在結(jié)構(gòu)上具有同源性，可跨越種屬誘導宿主間葉組織細胞分化成骨。BMP作用是軟骨內(nèi)化骨和膜內(nèi)化骨，即誘導間充質(zhì)細胞分化為骨細胞至成骨。低等動物的BMP仍能在高等動物體內(nèi)誘導成骨。

動物和人骨提取的BMP均為一混合多肽成分，分子量多集中在14、18、22、30KD，誘導成骨量與BMP劑量成正相關(guān)，BMP活性單位的定量尚無統(tǒng)一理想方法。BMP不溶于水而溶于高濃度鹽溶液中，可與骨基質(zhì)膠原和羥基磷灰石結(jié)合。BMP已在骨折愈合，骨缺損修復等領(lǐng)域內(nèi)顯示出潛在價值。

自從Urist在脫鈣骨基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)BMP提出骨誘導理論以來，有關(guān)BMP的研究工作取得了很大進展。迄今為止，通過基因重組技術(shù)分離和克隆出的BMP家族成員(BMPS)已經(jīng)超過40種，并且這一數(shù)量在不斷增加。在動物的生長發(fā)育過程中，BMPs及其受體幾乎遍及所有的組織器官，功能已涉及到胚胎學、發(fā)育學、進化學、基因?qū)W和病理學等多個學科。但BMP的骨誘導作用仍是其最基本和最重要的作用，在矯形外科有廣闊的應用前景。

二、背景技術(shù)——BMP的提取

BMP是一種生物活性蛋白，對濃度、pH、溫度等多種條件比較敏感；其提取過程是一系列的生物化學反應過程或物理變化過程。加快反應速度便可縮短提取時間，所以增大現(xiàn)有條件下反應物之間的分子碰撞機會可提高反應速度。

1.制作原理

BMP是一類能從多種動物骨皮質(zhì)中分離出來的低分子量酸性多肽，可以誘導未分化的間充質(zhì)細胞不可逆地分化為軟骨和骨組織，從而導致新骨形成I型膠原，常可提高材料的生物活性，促進細胞粘附。改進提取工藝，從動物骨中提取盡可能多的具良好活性的BMP是極重要的一項工作。

1)骨粒的粒度對BMP的產(chǎn)量及活性有重要影響。文獻介紹的骨粒度范圍較大，但多在125～2000μm。BMP的生物活性與其計量存在著正比關(guān)系，計量過小則易被很快吸收而不能對靶細胞形成足夠刺激。

2)膠原降解為明膠與BMP：明膠是膠原降解的產(chǎn)物，骨干骨通過氯仿甲醇等步驟的連續(xù)處理之后，即成為不溶性骨基質(zhì)明膠。把它植入同種的肌肉組織內(nèi)，或用它誘導體外培養(yǎng)的肌肉生長物時，就能產(chǎn)生新骨和軟骨。目前認為，骨基質(zhì)明膠的生物誘導活性是由于含有BMP之故。

2.BMP的提取步驟及方法

采用化學方法，即用CaCl₂—尿素無機和有機溶劑混合物從脫鈣骨皮質(zhì)明膠中提取出，在鹽酸胍和凝膠柱分步沉淀而制取的。這一過程是很麻煩的過程。雖然在移植骨基質(zhì)內(nèi)BMP含量甚微，但是為完成臨床的初步實驗能達到足夠的有效量。

如1973年Urist所述，表1總結(jié)了BMP的提取步驟和用不同方法分離的聯(lián)合的蛋白質(zhì)以及列表觀察各種蛋白部分植入后新骨形成的結(jié)果。

表1

三、發(fā)明內(nèi)容

1.制作原理