[發明專利]一種采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法

無效

• 申請號: 200710144911.1
• 申請日: 2007-12-24
• 公開（公告）號: CN101210262A
• 公開（公告）日: 2008-07-02
• 發明（設計）人: 王愛杰;于振國;任南琪;闞洪晶;劉春爽;張運晴;趙陽國
• 申請（專利權）人: 哈爾濱工業大學
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12Q1/68
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所
• 代理人: 單軍

1.一種采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法，其特征在于采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法按以下步驟進行：一、采用周冀中等人的DNA提取方法提取微生物群落DNA；二、PCR擴增：PCR擴增正向引物序列為AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，PCR擴增反向引物序列為TTACCGCGGCTGCTGGCA，反向引物5’端采用磷酸標記；三、酶切去除反意義鏈：酶切反應體系為50μL由5μL?10×buffer緩沖溶液、40μLPCR擴增產物和5μL濃度為5U/μL的λ核酸外切酶組成，酶切反應體系在37℃的環境中反應3～4h，然后純化酶切產物，再溶解于20μL重蒸餾水中；四、將溶解于重蒸餾水中的酶切產物與等體積的變性劑混合置于95℃的環境中熱變性處理10min，然后立即冰浴5min，之后凝膠電泳上樣、在4～20℃、電壓為250～300V的條件下電泳12～18h；五、將凝膠浸泡于重蒸餾水中10min，然后用滅菌的刀片將DNA條帶分別切下放入離心管中并研碎，再向每支離心管中加入50μL裂解液在37℃的環境中處理3h，然后離心、分離上清液，并向上清液中加入上清液體積2倍的無水乙醇，置于-20℃的環境中沉淀2h，再在24000g、4℃的條件下離心15min，沉淀物DNA在37℃的環境中干燥15min后加入10μL?TE溶液；六、對步驟五得到的沉淀物DNA分別進行分析，即得出微生物群落的組成結構；步驟四凝膠中丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺占凝膠總重量的10％～14％、甘油占凝膠總重量的5％～10％，其中丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺的質量比為49～55∶1；步驟四中變性劑由去離子甲酰胺和上樣緩沖液組成，其中上樣緩沖液由NaOH溶液、EDTA、溴酚藍、二甲苯氰FF和去離子水組成，上樣緩沖液中NaOH的濃度為10mM/L、EDTA的濃度為20mM/L、溴酚藍的濃度為0.02％(重量)、二甲苯氰FF的濃度為0.02％(重量)，去離子甲酰胺與上樣緩沖液的體積比為1∶3；步驟五中50μL的裂解液含有0.5M/L的乙酸銨、10mM/L的乙酸鎂，1mM/L、pH值為8.0的EDTA、0.1％(重量)的SDS和余量的重蒸餾水。

2.根據權利要求1所述的一種采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法，其特征在于步驟二中PCR反應程序為：94℃預熱5min，第一循環94℃變性40s、55℃退火40s、72℃延伸60s，循環30次，每循環退火溫度依次降低0.1℃，最后72℃延伸10min。

3.根據權利要求1所述的一種采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法，其特征在于步驟二中PCR反應體系為50μL由5μL?10×PCRbuffer、4μL?dNTP、1.5μL濃度為20μmol/L的正向引物、1.5μL濃度為20μmol/L的反向引物、0.125U?EX?Taq?DNA聚合酶、1～5ng微生物群落DNA和余量的去離子水組成；10×PCR?buffer中含有2.5mmol/L?Mg²⁺；dNTP中各種脫氧核苷三磷酸的濃度均為2.5μmol/L。

4.根據權利要求1所述的一種采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法，其特征在于步驟三中采用濃酚/氯仿核酸純化法提純核酸。

5.根據權利要求1所述的一種采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法，其特征在于步驟三中丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺占凝膠總重量的12％。

6.根據權利要求1所述的一種采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法，其特征在于步驟四中上樣量為15～20μL。

7.根據權利要求1所述的一種采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法，其特征在于步驟四電泳后采用核酸電泳銀染技術顯示DNA條帶。

8.根據權利要求1所述的一種采用單鏈構象多態性技術分析微生物群落結構組成的方法，其特征在于步驟四中在4℃、電壓為300V的條件下電泳18h。