[發明專利]一種雙氟米松人工抗原的制備方法

無效

• 申請號: 200710135244.0
• 申請日: 2007-11-01
• 公開（公告）號: CN101161681A
• 公開（公告）日: 2008-04-16
• 發明（設計）人: 胥傳來;袁媛;彭池方;李秋生;謝會玲
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;G01N33/531;G01N33/536;C07J5/00
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

一種雙氟米松人工抗原的制備方法，屬于生物化工領域。

背景技術

雙氟米松(Flumethasone，FLM)屬人工合成類糖皮質激素，化學名稱為6α，9α-雙氟孕甾-16α-甲基-11β，17α，21-三羥基-1，4-二烯-3，20二酮。具有抗過敏、抗炎的作用，其具有蓄積毒性，許多國家將此藥物列入禁用藥物名單，尤其是牛肉制品及牛奶中不得檢出。當今國際上常用的雙氟米松殘留的檢測方法有：薄層色譜(TLC)、液相色譜(LC)、氣相色譜(GC)、氣-質聯用法(GC-MS)、液-質聯用法(LC-MS)等，但這些儀器分析方法不僅需要昂貴的儀器設備，對檢材的要求也比較高，需要經過復雜的樣品前處理才能進行。國外早已經開展了對雙氟米松免疫分析方法的研究，但國內目前在這方面還是一片空白。為了加強對國內肉制品的監督力度和保障人民的身體健康，有必要展開對雙氟米松免疫分析方法的研究，有必要提供一種有效的雙氟米松人工抗原的制備方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種雙氟米松人工抗原的制備方法，所制備的產品可用于糖皮質激素類免疫方法的研究，為今后人們的研究提供了方便的途徑。

本發明的技術方案：一種雙氟米松人工抗原的制備方法，以雙氟米松為原料，利用丁二酸酐與雙氟米松反應生成雙氟米松琥珀酸半酯，得到人工半抗原；利用活性酯法使半抗原轉變為活性酯中間體，然后使之與牛血清蛋白結合，制備雙氟米松的人工抗原即雙氟米松-牛血清蛋白。其反應方程式為：

雙氟米松?????????????????????????????雙氟米松-21-琥珀酸半酯

???????????????????????????雙氟米松-牛血清蛋白

工藝步驟為：

(1)人工半抗原的制備：

雙氟米松和丁二酸酐配料摩爾比為1∶3，稱取雙氟米松0.4mmol和丁二酸酐1.2mmol置于50mL圓底燒瓶中，加入2.5mL無水吡啶，在60℃下加熱攪拌6h，將反應物轉入10mL含10％鹽酸的4℃冰水中，有白色沉淀析出，離心除去吡啶及過量的丁二酸酐，濾餅用去離子水洗滌數次，離心，干燥箱干燥后得到雙氟米松半抗原，置于4℃保存；

硅膠薄層板的制作：稱取硅膠12g，溶解在40mL?0.5％質量濃度的羥甲基纖維素鈉溶液中，用玻璃棒充分攪拌成糊狀，超聲波振蕩1分鐘，均勻涂布在玻璃板上，置于陰涼處自然干燥后，放入105℃的烘箱中活化1h，最后放入干燥箱中備用；

薄層層析法檢測：硅膠薄板下端1cm處作一水平線，吸取反應液1μL點于線上，點樣結束后吹干，將薄板放入層析缸中，層析液為甲醇∶氯仿∶氨水體積比為21∶78∶1，展開至薄板3.5-4cm處，取板，吹干溶劑，將薄板置于紫外分析儀中，在254nm波長觀察，在Rf為0.21處觀察到顯色點作為反應終點；

(2)人工抗原的制備：

制備A液：稱取0.09mmol半抗原，0.09mmol?N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，0.099mmol?N，N-二環己基碳二亞胺(DCC)于20mL燒杯中，溶解于1.8mL的二氧六環中，室溫下攪拌過夜，離心后棄沉淀，清液為活性酯中間體，為A液；

磷酸鹽緩沖液(PBS)：配制0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液：磷酸氫二鈉71.64g加水至1000mL。配制0.2mol/L的磷酸二氫鈉溶液：磷酸二氫鈉35.61g加水至1000mL。將0.2mol/L的磷酸氫二鈉溶液94.7mL與0.2mol/L的磷酸二氫鈉溶液5.3mL混合即為pH8.0的磷酸鹽緩沖液；

制備B液：稱取120.6mg的牛血清蛋白溶解于9mL的pH?8.0的磷酸鹽緩沖液中，4℃低溫攪拌半小時，此液為B液；

在4℃低溫攪拌下，將A液逐滴地滴加到B液中，全部滴完后，混合液攪拌1小時恢復至室溫，即得到人工抗原混合液；

透析袋前處理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，再用60℃的去離子水沖洗3min，保存在4℃去離子水中備用；

將人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的超純水透析3天，最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得到人工抗原：雙氟米松-牛血清蛋白。

(3)雙氟米松人工抗原的鑒定

估算偶聯物中被偶聯的兩種分子的比率(偶聯比率)的方法，雖然種類很多，但都是依據檢測偶聯物中被偶聯的兩種分子含量(或相對含量)的原理建立起來的.分光光度法是利用物質對光的吸收與其濃度呈比例關系的原理分別