[發(fā)明專利]一種地賽米松人工抗原的制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710135242.1
• 申請(qǐng)日: 2007-11-01
• 公開（公告）號(hào): CN101161679A
• 公開（公告）日: 2008-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胥傳來;袁媛;彭池方;尹麗梅;陳偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/765
• 分類號(hào): C07K14/765;G01N33/531;G01N33/536;C07J5/00
• 代理公司: 無錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 時(shí)旭丹;劉品超

1.一種地賽米松人工抗原的制備方法，其特征是以地賽米松為原料，利用丁二酸酐與地賽米松反應(yīng)生成地賽米松琥珀酸半酯，得到人工半抗原；利用活性酯法使半抗原轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚怎ブ虚g體，然后使之與牛血清蛋白結(jié)合，制備地賽米松的人工抗原即地賽米松-牛血清蛋白；步驟為：

(1)人工半抗原的制備：

地賽米松和丁二酸酐配料摩爾比為1∶3，稱取地賽米松0.8mmol和丁二酸酐2.4mmol于50mL圓底燒瓶中，加入5mL無水吡啶，混合物在60℃下加熱攪拌反應(yīng)6h，將反應(yīng)物轉(zhuǎn)入20mL含10％鹽酸的4℃冰水中，有白色沉淀析出，離心除去吡啶及過量的丁二酸酐，濾餅用去離子水洗滌數(shù)次，離心，干燥箱干燥后得到地賽米松半抗原，置于4℃保存；

硅膠薄層板的制作：稱取硅膠12g，溶解在40mL?0.5％質(zhì)量濃度的羥甲基纖維素鈉溶液中，用玻璃棒充分?jǐn)嚢璩珊隣睿暡ㄕ袷?分鐘，均勻涂布在玻璃板上，置于陰涼處自然干燥后，放入105℃的烘箱中活化1h，最后放入干燥箱中備用；

薄層層析法檢測(cè)：硅膠薄板下端1cm處作一水平線，吸取反應(yīng)液1μL點(diǎn)于線上，點(diǎn)樣結(jié)束后吹干，將薄板放入層析缸中，層析液為甲醇∶氯仿∶氨水體積比為21∶78∶1，展開至薄板3.5-4cm處，取板，吹干溶劑，將薄板置于紫外分析儀中，在254nm波長觀察，在Rf為0.21處觀察到顯色點(diǎn)作為反應(yīng)終點(diǎn)；

(2)人工抗原的制備：

制備A液：稱取0.09mmol半抗原，0.09mmol?N-羥基琥珀酰亞胺，0.099mmolN，N-二環(huán)己基碳二亞胺于20mL燒杯中，溶解于1.8mL的二氧六環(huán)中，室溫下攪拌過夜，離心后棄沉淀，清液為活性酯中間體，為A液；

磷酸鹽緩沖液：將0.2mol/L的磷酸氫二鈉溶液94.7mL與0.2mol/L的磷酸二氫鈉溶液5.3mL混合即為pH?8.0的磷酸鹽緩沖液；

制備B液：稱取120.6mg的牛血清蛋白溶解于9mL的pH?8.0的磷酸鹽緩沖液中，4℃低溫?cái)嚢璋胄r(shí)，此液為B液；

在4℃低溫?cái)嚢柘拢瑢液逐滴地滴加到B液中，全部滴完后，混合液攪拌1小時(shí)恢復(fù)至室溫，即得到人工抗原混合液；

透析袋前處理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，再用60℃的去離子水沖洗3min，保存在4℃去離子水中備用；

將人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的超純水透析3天，最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得到人工抗原：地賽米松-牛血清蛋白。