[發明專利]一種用于基因序列差異測定的方法

無效

• 申請號: 200710131454.2
• 申請日: 2007-09-10
• 公開（公告）號: CN101386883A
• 公開（公告）日: 2009-03-18
• 發明（設計）人: 周國華
• 申請（專利權）人: 周國華
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司
• 代理人: 夏 平;劉成群

技術領域

本發明屬于一種用于遺傳分析的檢測方法，涉及一種用于基因序列差異測定的方法，具體來說是一種通過連接反應，將一對含有堿基序列標簽的探針連接起來，然后通過核酸擴增反應和測序反應來測定基因序列的差異。用于檢測基因組序列中的單堿基多態性，拷貝數差異，DNA片斷的重復與缺失。

背景技術

隨著人類基因組序列的完成，人的遺傳基因序列差異與疾病的易感性和藥物的敏感性的關系已經越來越清楚。基因序列的差異主要包括單核苷酸多態性(SNP)、序列重復和序列缺失，其中單核苷酸多態性是指基因組DNA中某一特定核苷酸位置上發生轉換、顛換、插入或缺失等變化。基因序列重復和缺失指一段基因的部分序列、一種基因的某個外顯子序列、某種基因的全部序列、甚至整個一組染色體序列的重復或缺失，例如60％以上的杜氏肌營養不良(DMD)是由于DMD基因中一個或多個外顯子的缺失和重復；又如PPARG基因中外顯子的重復與缺失與II型糖尿病高度相關；X-連鎖隱性遺傳的腦白質營養不良病(Pelizaeus-Merzbacher病)是Xq13-q22染色體上蛋白脂蛋白基因序列重復所致。

SNP具有數量多、分布廣和穩定遺傳等特點，是決定人類疾病易感性和藥物反應差異的重要遺傳因素。通常認為SNP只有兩種類型，即雙等位基因(biallelic)。因此，在對已知突變位點檢測時只需對SNP進行兩種不同類型堿基的確認分析，而無需對DNA片段進行全序列測定。目前用于基因序列差異分析的技術主要集中在SNP分析，發展了許多SNP檢測技術，它們主要基于以下四種基本原理：(1)等位基因特異性雜交；(2)內切酶酶切技術；(3)引物延伸法；(4)寡核苷酸連接反應。其檢測系統也發展很快，測定激光誘導熒光是檢測SNP最為常用的方法，有許多檢測系統都采用了熒光檢測的原理，如平板讀數儀、基因芯片和微球陣列技術等。為了實現特異性SNP檢測，熒光共振能量轉移和熒光偏振是常用的兩種信號指示系統，被多種檢測平臺成功利用。除了熒光檢測平臺以外，質譜儀也被廣泛用于SNP的檢測。但這些方法的價格昂貴，新發展的焦測序(pyrosequencing)技術采用生物發光為檢測平臺，在進行DNA序列分析時不需要電泳，不需要熒光標記，可以直接測定引物后面的堿基序列，定量性能好，結果準確，可實現自動化，是一種較好的SNP分析工具，但測定通量較低。

與SNP測定相比，基因序列的重復和缺失的測定方法較少，主要有熒光原位雜交法(FISH)和比較基因組雜交法(CGH)等。但這些方法費時、費力；難于檢測單個基因外顯子的重復和缺失；也難以實現多重檢測，測定樣本通量很低；另外需要大量的樣本量。雖然采用PCR擴增技術可以檢測基因序列的缺失，但難以檢測大片段序列的重復；實時熒光PCR可以檢測序列的重復，但一次只能測定一個樣本。目前尚未有一種簡單、方便、通量高、成本較低、且能同時測定多種堿基序列變化的方法。

發明內容

本發明針對上述不足之處，提供一種基因序列差異測定的方法。該方法不采用熒光標記的方法，而采用核酸標記連接探針的方法，可實現在單管中同時檢測多個(2-50個)基因序列差異(含單堿基多態性、序列重復和缺失)。

一種用于基因序列差異測定的方法，包括下列步驟：a.將多對含有堿基序列標簽的探針與待測基因序列雜交；b.在連接酶的作用下，通過連接反應將步驟a中的每對相鄰探針連接在一起；c.采用擴增反應擴增步驟b得到的連接反應產物；d.采用測序技術測定步驟c中擴增產物中的序列標簽；e.以步驟d中測得的序列及各序列相應的信號強度分析基因序列的差異。

所述的用于基因序列差異測定的方法，其中連接反應是指與待測模板互補的兩相鄰探針的5’端和3’端連接起來的反應。

所述的用于基因序列差異測定的方法，其中探針是指含有兩部分序列，一部分與待測模板序列互補，一部分與待測模板序列不互補。

所述的用于基因序列差異測定的方法，其中堿基序列標簽是指一段含有待測模板位置特異性的編碼序列或者指一段含有待測模板序列差異特異性的編碼序列。

所述的用于基因序列差異測定的方法，其中堿基序列標簽是指一段含有DNA擴增用引物特異性的序列。

所述的用于基因序列差異測定的方法，其中序列差異是指基因組序列中的單堿基多態性，或拷貝數差異，或DNA片斷的重復與缺失。