[發明專利]一種檢測脂肪酶活力抑制率的方法

無效

• 申請號: 200710120015.1
• 申請日: 2007-08-07
• 公開（公告）號: CN101363043A
• 公開（公告）日: 2009-02-11
• 發明（設計）人: 段震文;郭樹仁;何大林;閆雪秋
• 申請（專利權）人: 北京北大維信生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34
• 代理公司: 北京太兆天元知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 張韜

1.一種檢測脂肪酶活力抑制率的方法，其特征在于該方法包括如下步 驟：

A.準備試劑、橄欖油乳化液及測定酶液：

三羥甲基氨基甲烷緩沖液制備：取三羥甲基氨基甲烷3-4重量份，用0.1 mol/L鹽酸溶液調pH值至7.5-9.5，加水至400-600體積份，搖勻，再調節 pH值至7.5-9.5，定容至400-600體積份；

橄欖油乳化液的制備：取橄欖油10-15體積份與阿拉伯樹膠20-25重量 份，研磨均勻，加水研磨至200-400體積份，用18000轉/min的勻質機乳化 1-3次，每次2-4分鐘；取乳劑在顯微鏡下檢查，90％乳粒的直徑在3μm以下， 并不得有10μm的乳粒，即可；

牛膽鹽溶液的制備：精密稱取牛膽鹽5-10重量份，置于50ml燒杯中， 以水溶解，轉移至100ml容量瓶中定容；

氫氧化鈉溶液的制備：精密稱取氫氧化鈉1-3重量份，加水溶解定容至 500重量份；

脂肪酶溶液的制備：精密稱取標準脂肪酶于容量瓶中，用冷卻至5℃以 下的三羥甲基氨基甲烷緩沖液溶解，制成每1ml中含胰脂肪酶10～200活力 單位的溶液，作為酶原液備用；繪制標準曲線時，將酶原液用三羥甲基氨基 甲烷緩沖液稀釋至不同濃度梯度的測定酶液；0U/ml的測定酶液是在水浴中 煮沸15-30分鐘的酶原液，也可以用三羥甲基氨基甲烷緩沖液代替；

B.建立脂肪酶測活體系：

1).空白溶液脂肪酶測活體系：取橄欖油乳液20-30重量份、牛膽鹽溶 液1-3重量份與水5-15重量份，置100ml三角瓶中，加空白溶液1-3重量 份，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至8-10，空白溶液是水或乙醇；

2).樣品溶液脂肪酶測活體系：取橄欖油乳液20-30重量份、牛膽鹽溶 液1-3重量份與水5-15重量份，置100ml三角瓶中，加樣品溶液1-3重量 份，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至8-10，樣品溶液是用相應的空白 溶液溶解或提取的具有潛在的抑制脂肪酶活力的物質的測定溶液；

C.繪制脂肪酶抑制率“Y％”與pH變化幅度“ΔpH”關系標準曲線：

繪制標準曲線時，先將不同梯度的測定酶液換算成對應的抑制率，抑制 率換算公式：

Y(％)＝(X₀-Xn)/X₀

Y(％)-表示脂肪酶抑制率

X₀-表示酶原液濃度(U/ml)

Xn-表示不同稀釋度的酶液濃度(U/ml)；

設定酶濃度為零時，抑制率為100％；設定酶原液濃度的抑制率為0，將 酶原液按一定梯度稀釋成90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、 40U/ml、30U/ml、20U/ml、10U/ml的測定酶液，則對應的抑制率Y％分 別為10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％；空白酶液(0U/ml) 是在水浴中煮沸15-30分鐘的酶原液或是用三羥甲基氨基甲烷緩沖液代替， 按照標準曲線繪制法繪制標準曲線；

標準曲線繪制法：將上述空白溶液脂肪酶測活體系在35-40℃水浴中保 溫5-15分鐘，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至8-10；精密量取上述 不同濃度梯度的測定酶液1體積份，分別加至空白溶液測活體系中，在35-40 ℃水浴中準確反應2-30分鐘，同時記錄反應前后pH值，并計算反應前后的 pH差值；用酶濃度為100U/ml時反應前后的pH差值，分別減去酶濃度為 90U/ml、80U/ml、70U/ml、60U/ml、50U/ml、40U/ml、30U/ml、20U/ml、 10U/ml、0U/ml時反應前后的pH差值，即得到對應不同抑制率的pH變化 幅度“ΔpH”值；以抑制率“Y％”為縱坐標，“ΔpH”值為橫坐標，繪制脂 肪酶抑制率“Y％”與pH變化幅度“ΔpH”關系標準曲線，并得到相應空白 溶液的抑制率計算公式；

D.測定方法及樣品溶液脂肪酶抑制率

空白溶液測定：將空白溶液脂肪酶測活體系在35-40℃水浴中保溫5-15 分鐘，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至8-10；精密量取酶原液1體 積份加至空白溶液測活體系中，在35-40℃水浴中準確反應2-30分鐘，同時 記錄反應前后pH值，并計算空白溶液反應前后的pH差值，記為A1；另取在 水浴中煮沸15-30分鐘的上述酶原液1體積份，照上述方法測定，作為酶空 白對照，pH差值記為A0；則空白溶液酶反應的pH變化值為ΔA＝A1-A0；

樣品溶液測定：將樣品溶液脂肪酶測活體系在35-40℃水浴中保溫5-15 分鐘，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至8-10；精密量取酶原液1體 積份加至樣品溶液測活體系中，在35-40℃水浴中準確反應2-30分鐘，同時 記錄反應前后pH值，并計算樣品溶液反應前后的pH差值，記為B1；另取在 水浴中煮沸15-30分鐘的上述酶原液1體積份，照上述方法測定，作為酶空 白對照，pH差值記為B0；則樣品溶液酶反應的pH變化值為ΔB＝B1-B0；

樣品溶液脂肪酶抑制率：用空白溶液酶反應的pH變化值“ΔA”減去樣 品溶液酶反應的pH變化值“ΔB”，得到空白溶液與樣品溶液酶反應的“Δ pH”值，即ΔpH＝ΔA-ΔB，將此“ΔpH”值代入相應的空白溶液脂肪酶抑 制率計算公式，即得測定樣品的脂肪酶抑制率；

上述檢測方法中重量份/體積份是g/ml的關系。