[發(fā)明專利]一種生產(chǎn)4，6-二氨基間苯二酚的方法及其專用工程菌

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710119069.6
• 申請(qǐng)日: 2007-06-19
• 公開（公告）號(hào): CN101100654A
• 公開（公告）日: 2008-01-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉雙江;楊勇;姜嘉彤;劉志培;姜成英
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/52;C12P7/22
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 關(guān)暢

1、可表達(dá)羥氨苯歧位酶的工程菌，是將羥氨苯歧位酶基因通過原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，篩選獲得的可表達(dá)羥氨苯歧位酶的工程菌。

2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述羥氨苯歧位酶基因的核苷酸序列是自GENBANK號(hào)為DQ207951的5′端的第1802-2264位核苷酸序列。

3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的工程菌，其特征在于：所述羥氨苯歧位酶基因是以睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas?testosteroni)CNB-1?CGMCC?No.1028的基因組DNA為模板，用核苷酸序列分別為序列表中序列1和序列2的一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的。

4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的工程菌，其特征在于：所述原核表達(dá)載體為pET-21a(+)，所述大腸桿菌菌株為大腸桿菌BL21(DE3)；所述羥氨苯歧位酶基因優(yōu)選為通過將所述PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)過EcoRI和HindIII雙酶切處理后，插入到所述pET-21a(+)的EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn)之間得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入所述大腸桿菌中的。

5、一種生產(chǎn)4，6-二氨基間苯二酚的方法，包括下述步驟：

1)將權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的工程菌進(jìn)行發(fā)酵至對(duì)數(shù)期，然后誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)得到含有羥氨苯歧位酶的工程菌；

2)以2-氨基-4-羥氨酚為底物，用步驟1獲得的含有羥氨苯歧位酶的工程菌進(jìn)行催化反應(yīng)，得到4，6-二氨基間苯二酚。

6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述步驟2)中，所述催化反應(yīng)的溫度為10-50℃，優(yōu)選為37℃。

7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述步驟2)中，所述含有羥氨苯歧位酶的工程菌以完整細(xì)胞懸浮液或固定化細(xì)胞的形式進(jìn)行催化反應(yīng)；所述固定化細(xì)胞優(yōu)選為固定化微球。

8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述固定化微球的載體為海藻酸鈣；所述固定化微球的直徑為2-4mm；

所述步驟1)中，所述誘導(dǎo)表達(dá)的試劑為IPTG，所述誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)的溫度為15-25℃，優(yōu)選為18℃，所述誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)的時(shí)間為12-36小時(shí)，優(yōu)選為24小時(shí)；

所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為30-40℃，優(yōu)選為37℃。

9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于：所述步驟2)中，還包括用2-氨基-4-硝基酚與鋅反應(yīng)得到2-氨基-4-羥氨酚；所述2-氨基-4-硝基酚與鋅反應(yīng)的溫度為30-80℃，優(yōu)選為60℃；所述2-氨基-4-硝基酚存在于含NH₄Cl的溶液中；所述溶液中，所述2-氨基-4-硝基酚的濃度為0.1-1.0g/L，NH₄Cl的濃度為0.5-5.0g/L；所述溶液優(yōu)選為含1.0g/L?2-氨基-4-硝基酚和1.39g/L?NH₄Cl的溶液。

10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于：所述方法中，還包括將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化得到純化的4，6-二氨基間苯二酚鹽酸鹽；所述分離純化是將反應(yīng)得到的溶液用絡(luò)合萃取劑萃取，取有機(jī)相再經(jīng)含有質(zhì)量百分含量為1％的氯化亞錫的3.5mol/L的鹽酸溶液萃取，取底層無機(jī)相，用活性碳脫色，結(jié)晶，重復(fù)脫色結(jié)晶直到得到無色透明晶體，即為純化的4，6-二氨基間苯二酚鹽酸鹽；所述絡(luò)合萃取劑為含有體積比為20∶30∶50的D2EHPA、正辛醇和煤油的混合液；所述活性碳脫色的溫度為55-80℃。