[發明專利]利用細胞行為調控獲取纖維堆囊菌液體發酵菌株的方法

無效

• 申請號: 200710115611.0
• 申請日: 2007-12-17
• 公開（公告）號: CN101220341A
• 公開（公告）日: 2008-07-16
• 發明（設計）人: 李越中;胡瑋
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/01
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司
• 代理人: 王緒銀

1.一種利用細胞行為調控技術獲取纖維堆囊菌液體發酵優良菌株的方法，包括：

(1)纖維堆囊菌菌株胞外多糖分泌的減少或去除，

(2)纖維堆囊菌社會性細胞行為特征的去除，

(3)纖維堆囊菌液體分散生長的實現，

(4)生長迅速、代時減少的纖維堆囊菌液體發酵優良菌株的獲得；

其特征是：

步驟(1)所述的纖維堆囊菌菌株胞外多糖分泌的減少或去除是指：

進行纖維堆囊菌菌株連續液體傳代培養時，在MML液體培養基中添加非離子型表面活性劑，濃度從0.05％依次遞增到0.5％，每級梯度增加0.15％，在一個濃度條件下進行兩次或兩次以上的傳代培養，逐級進行，最終實現纖維堆囊菌菌體液體培養時胞外粘液類物質的減少或去除；

步驟(2)所述的纖維堆囊菌社會性細胞行為特征的去除是指：

將獲得的胞外多糖產生能力顯著降低的菌株接種于10-20ml液體CDM培養基中，30℃，120轉/分搖床培養至穩定期前期，然后加入100-200ml新鮮CDM培養基稀釋菌體，取出10-20ml混合液繼續30℃，120轉/分搖床培養，每兩天進行一次同樣的稀釋和再培養，重復50-100次，即獲得社會性細胞行為特征去除的纖維堆囊菌；

步驟(3)所述的纖維堆囊菌液體分散生長的實現足指：

將獲得的社會性細胞行為特征去除的菌體轉入MML液體培養基搖瓶中，30℃，200rpm搖床培養至指數期，倒棄2/3～9/10的培養液，并用殘留的液體沖刷菌體球，合并于滅菌的含玻璃珠及攪拌子的三角瓶內，置磁力攪拌器上打勻菌體，以1∶10的體積比例接種于新鮮的MML液體培養基中，30℃，200rpm搖床培養至指數期；重復這一過程，直至纖維堆囊菌菌株實現液體分散生長；

步驟(4)所述的生長迅速、代時減少的纖維堆囊菌液體發酵優良菌株的獲得是指：

通過步驟(1)至(3)的操作，獲得無社會性細胞行為特征并且在液體中分散生長的纖維堆囊菌菌株，然后進行發酵條件優化，尋找此類菌株的適合培養條件，篩得優化的液體培養基，進而獲得生長迅速、代時減少的纖維堆囊菌菌株，即為液體發酵的優良菌株。

2.如權利要求1所述利用細胞行為調控技術獲取纖維堆囊菌液體發酵優良菌株的方法，其特征在于：步驟(1)所述在液體培養基中添加非離子型表面活性劑是TritonX-100，或失水山梨醇單月桂酸酯類Span-20，Span-60，Span-40，Span-80，或聚環氧乙烷失水山梨醇單月桂酸酯類Tween-20，Tween-40，Tween?60，Tween-80中的一種，濃度以重量百分比計從0.05％依次遞增到0.5％，每級梯度增加0.15％，在一個濃度條件下進行兩次或兩次以上的傳代培養，逐級進行，最終實現減少或去除纖維堆囊菌菌株胞外多糖的分泌。

3.如權利要求1所述利用細胞行為調控技術獲取纖維堆囊菌液體發酵優良菌株的方法，其特征在于：步驟(2)所述CDM培養基的成分以重量百分比計為：脫脂奶粉0.05-0.1％，酵母粉0.05-0.1％，馬鈴薯淀粉0.5-1.0％，甘油0.1-0.2％，CaCl₂·2H₂O?0.05-0.15％，MgSO₄·7H₂O?0.05-0.15％，Fe-EDTA?6-10mg/L，HEPES?30-60mmol/L，pH?7.0-7.3。

4.如權利要求1所述的一種利用細胞行為調控技術獲取纖維堆囊菌液體發酵優良菌株的方法，其特征在于：步驟(1)或(3)所述MML液體發酵培養基的成分為：地瓜淀粉15～35g/L，水解乳蛋白8～20g/L，CaCl₂·2H₂O?0.8～1.5g/L，MgSO₄·7H₂O?0.7～1.4g/L，Fe-EDTA?5～10mg/L。

5.如權利要求1所述的一種利用細胞行為調控技術獲取纖維堆囊菌液體發酵優良菌株的方法，其特征在于：步驟(4)所述獲得的液體發酵菌株在液體培養時能夠分散生長，代時能由野生型的12-16小時縮短到4-5小時。