[發明專利]金黃色葡萄糖球菌快速檢測試劑盒的制備和使用方法

有效

• 申請號: 200710115176.1
• 申請日: 2007-12-13
• 公開（公告）號: CN101200762A
• 公開（公告）日: 2008-06-18
• 發明（設計）人: 高宏偉;肖西志;梁成珠;劉心同
• 申請（專利權）人: 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司
• 代理人: 張中南

1.一種金黃色葡萄糖球菌快速檢測試劑盒，其特征在于其中的試劑包括如下(1)-(4)：

(1)環介導等溫擴增反應液A：

含有10×Thermopol反應緩沖液、300-500μmol/L?dNTP、2-4mmol/L硫酸鎂、0.8-1.2μmol/L上游內引物、0.8-1.2μmol/L下游內引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜堿；其中10×Thermopol反應緩沖液含有200mmol/L?pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和1％曲拉通X-100；

其中上游內引物5-TGCATTCCTGGAATAATGACGCGTTAAAGAAGATGGTATGTGGAAG-3、

下游內引物5-CAGAACGTGGTAAAATTTTAGACCGATCTCATATGCTGTTCCTGTA-3、

上游外引物5-CATTGATCGCAACGTTCAA-3、

下游外引物5-TTCTTTGGAACGATGCCT-3；

(2)UNG酶：1U/μL；

(3)Bst?DNA聚合酶B：8U/μL；

(4)顯色劑C：為10％的熒光染料SYBR?GREEN?I或者DNAGreen。

2.根據權利要求1中所述的金黃色葡萄糖球菌快速檢測試劑盒，其特征是上述的dNTP內的四種脫氧核糖核酸的質量比為dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。

3.根據權利要求1中所述的金黃色葡萄糖球菌快速檢測試劑盒，其特征是上述的環介導等溫擴增反應液A每管23μL的組成為：2.5μL?10×Thermopol反應緩沖液、1.0μL?10mmol/L?dNTP、1.0μL?20μmol/L上游內引物、1.0μL?20μmol/L下游內引物、0.25μL?20μmol/L上游外引物、0.25μL?20μmol/L下游外引物、0.5μL?100mmol/L?MgSO₄、12.5μL?2mol/L甜菜堿和4μL?ddH₂O。

4.一種金黃色葡萄糖球菌快速檢測試劑盒的使用方法，其特征是依次包括下列步驟：

(1)待檢樣品或細菌DNA的提取：

A.取200mg待檢樣品或者1.0-1.5mL過夜培養的菌液，置于1.5mL離心管中，用臺式離心機10000-12000轉/分離心5-10min，棄上清液；

B.加入1.0-1.5mL滅菌雙蒸水，混勻，用臺式離心機10000-12000轉/分離心5-10min，棄上清液；

C.加入100-150μL滅菌雙蒸水，混勻，100℃沸水浴中加熱10-15min；

D.然后用臺式離心機10000-12000轉/分離心5-10min，取上清至一個新的1.5mL離心管中，即為待檢樣品模板DNA。

(2)進行金黃色葡萄糖球菌的環介導等溫擴增反應：

A.在裝有23μL?LAMP反應液A的反應管中加入1μL待檢樣品模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒溫金屬浴上95℃放置3-5min，立即置于冰上1-3min；

B.在上述反應管中加入1μL?Bst?DNA聚合酶B；

C.再于恒溫金屬浴上60-65℃放置45-90min；

D.將金屬浴調到80-95℃中止反應，3-5min后取出待檢；

(3)顯色檢測：

在待檢的每個反應管中加入1μL顯色劑C，直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明待檢樣品或者細菌不含有或者是金黃色葡萄糖球菌，如果顏色變為綠色，則說明待檢樣品或細菌為金黃色葡萄糖球菌。