[發明專利]一種基于選擇性探針的多重PCR方法及其應用

無效

• 申請號: 200710107080.0
• 申請日: 2007-05-18
• 公開（公告）號: CN101067156A
• 公開（公告）日: 2007-11-07
• 發明（設計）人: 黃慶;府偉靈;王玨;黃君富
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12P19/34
• 代理公司: 北京瑞盟知識產權代理有限公司
• 代理人: 孫民興;顧小曼

1、一種基于選擇性探針的多重PCR方法，其特征是，包括以下步驟：

(1)構建選擇性探針：

選擇性探針的5’-端和3’-端分別設置一個與靶雙鏈核酸序列的同一條核酸單鏈序列的5’-和3’-端或者靶單鏈核酸序列的5’-端和3’-端互補的互補區，兩個互補區的中間部分設置為兩個通用序列區；通用序列區與互補區直接相連，或者通過標簽序列相連接；兩個通用序列區直接相連，或者中間設置一個尿嘧啶區，通過尿嘧啶區的尿嘧啶寡核苷酸相連；

(2)延伸-連接反應：

將下列物質混合，進行延伸-連接反應：

①起始核酸模板；

②步驟(1)所構建的選擇性探針；

③四種三磷酸脫氧核糖核苷酸，包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP；

④DNA連接酶和DNA聚合酶，及其相應的緩沖液體系；或者，逆轉錄酶和DNA聚合酶，及其相應的緩沖液體系；

(3)PCR擴增：

其中反應物包括：延伸-連接反應產物、與選擇性探針的通用序列對應的一對通用引物、四種三磷酸脫氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP和dGTP)、DNA聚合酶及其相應的緩沖液體系；所述的一對通用引物，其中，一條通用引物與選擇性探針的一個通用序列區的序列相同，另一條通用引物則與選擇性探針另一個通用序列區的序列互補；

(4)檢測PCR擴增產物，以確定待檢樣本中是否存在靶核酸和/或靶核酸的拷貝數。

2、根據權利要求1所述的一種基于選擇性探針的多重PCR方法，其特征是，所述步驟(1)中所述的標簽序列具有自身特異性，所述標簽序列是長度為15～40聚體的寡核苷酸，所述標簽序列的Tm值之差小于或等于5℃，相互之間以及與通用引物之間無交叉雜交，并且無發夾結構；所述標簽序列與待檢樣本的物種基因組核酸序列無同源性或同源性較低。

3、根據權利要求1所述的一種基于選擇性探針的多重PCR方法，其特征是，所述步驟(2)中所述的起始核酸模板包括基因組DNA、甲基化酶感限制性內切酶(MSRE)酶切DNA、MSRE同裂酶酶切DNA、McrBC酶切DNA、重亞硫酸鹽修飾DNA、RNA、mRNA或cDNA核酸片段。

4、根據權利要求1所述的一種基于選擇性探針的多重PCR方法，其特征是，所述步驟(1)中所述的選擇性探針的部分或全部堿基含有堿基類似物或堿基修飾物；或者

選擇性探針中的兩個靶核酸互補區引入人工錯配堿基，所述人工錯配堿基是天然的A、T、C、G四種堿基或其類似物；或者

當起始核酸模板是RNA或mRNA時，選擇性探針3′-端的靶核酸互補區是Oligo?d(T)，Oligo?d(T)的長度是8～40聚體。

5、根據權利要求1所述的一種基于選擇性探針的多重PCR方法，其特征是，所述步驟(3)中所述的通用引物標記有熒光分子、發光基團、生物素、地高辛分子或同位素，或其它類似發光分子或適合分離擴增產物的標記分子；或者

通用引物部分或全部堿基含有堿基類似物或堿基修飾物；或者

四種三磷酸脫氧核糖核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)的一種或多種標記有熒光分子、發光基團、生物素、地高辛分子、同位素，或其它類似發光分子或適合分離擴增產物的標記分子。

6、根據權利要求1所述的一種基于選擇性探針的多重PCR方法，其特征是，所述步驟(2)延伸-連接反應后，還可對延伸-連接反應產物進行如下處理：采用線性單鏈或雙鏈DNA特異性核酸外切酶處理延伸-連接反應產物，使處理完畢后，延伸-連接反應產物中僅有環狀單鏈DNA分子保持完整性；或者

采用尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)處理延伸-連接反應產物，使處理完畢后，環狀單鏈DNA分子解體為線性單鏈DNA分子。