[發(fā)明專利]基于馬傳染性貧血病毒(EIAV)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710102621.0
• 申請(qǐng)日: 1998-12-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101063151A
• 公開(kāi)（公告）日: 2007-10-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: A·J·金斯曼;M·W·卡洛爾;J·羅爾;K·米特洛法諾斯;N·金
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 牛津生物醫(yī)學(xué)（英國(guó)）有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/867
• 分類號(hào): C12N15/867;C12N15/86;C12N7/04;C12N5/10;A61K48/00
• 代理公司: 中國(guó)專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 劉玥

本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為1998年12月22日，申請(qǐng)?zhí)枮?8813766.6，發(fā)明名稱為“基于馬傳染性貧血病毒(EIAV)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

本發(fā)明涉及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，尤其(但不僅僅)涉及衍生自非靈長(zhǎng)類動(dòng)物慢病毒，并能將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移至非分裂或緩慢分裂細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

有段時(shí)間，人們對(duì)研制基于慢病毒(逆轉(zhuǎn)錄病毒的小亞組)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)相當(dāng)有興趣。這一興趣的誘因首先是使用基于HIV的載體將抗HIV治療劑靶向HIV易感細(xì)胞的想法，其次是下列推測(cè)，即由于慢病毒能感染非分裂細(xì)胞(Lewis?&?Emerman?1993，病毒學(xué)雜志，68，510)，基于這些病毒的載體系統(tǒng)將能轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞(如Vile?&?Russel?1995?Brit.Med.Bull，51，12)。基于HIV的載體系統(tǒng)已經(jīng)產(chǎn)生(Buchschacher?&?Panganiban?1992，病毒學(xué)雜志，66，2731)，使用該系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)了CD4+細(xì)胞，并按預(yù)期的那樣轉(zhuǎn)導(dǎo)了非分裂的細(xì)胞(Naldini等，1996科學(xué)272，263)。另外，慢病毒載體能很穩(wěn)定地長(zhǎng)期表達(dá)所需基因。對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的大鼠神經(jīng)元細(xì)胞而言至少為3個(gè)月。基于MLV的載體僅能在6周內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)所需基因。

迄今為止產(chǎn)生的基于HIV的載體在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中導(dǎo)致整合的原病毒，其末端具有的HIV?LTR限制了這些載體的使用，因?yàn)槌鞘褂脙?nèi)部啟動(dòng)子，否則LTR不得不用作任何插入基因的表達(dá)信號(hào)。內(nèi)部啟動(dòng)子的使用具有顯著的缺陷，將其它啟動(dòng)子置于逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)會(huì)導(dǎo)致不可預(yù)測(cè)的后果，其詳細(xì)記載于Bowtell等，1988，病毒學(xué)雜志，62，2464；Correll等，1994，血液84，1812；Emerman和Temin?1984細(xì)胞39，459；Ghattas等，1991，分子細(xì)胞生物學(xué)，11，5848；Hantzopoulos等，1989?PNAS?86，3519；Hatzoglou等，1991，生物化學(xué)雜志，266，8416；Hatzoglou等，1988，生物化學(xué)雜志，263，17798；Li等，1992，人類遺傳學(xué)理論，3，381；McLachlin等，1993，病毒學(xué)，195，1；Overell等，1988，分子細(xì)胞生物學(xué)，8，1803；Scharfman等，1991?PNAS?88，4626；Vile等，1994，基因理論，1，307；Xu等，1989，病毒學(xué)，171，331；Yee等，1987?PNAS84，5197。涉及的因素包括兩個(gè)啟動(dòng)子的相對(duì)位置和方向，啟動(dòng)子的特性，表達(dá)的基因和所采用的任何選擇方法。內(nèi)部啟動(dòng)子的存在會(huì)影響包裝細(xì)胞系所能達(dá)到的轉(zhuǎn)導(dǎo)效價(jià)和整合載體的穩(wěn)定性。

HIV和其它慢病毒LTR對(duì)基因表達(dá)具有病毒特異性的需求。例如，HIV?LTR在缺乏病毒Tat蛋白時(shí)不具活性(Cullen?1995?AIDS?9，S19)。因此，需要以某種方式修飾LTR以改變基因表達(dá)的需求。一些基因治療應(yīng)用特別地需要組織特異性的基因表達(dá)。

HIV載體有很多顯著的缺陷，限制了它們對(duì)某些疾病的治療應(yīng)用。HIV-1的缺陷在于它是攜有潛在的致癌蛋白質(zhì)和序列的人類病原體。導(dǎo)入在包裝細(xì)胞中產(chǎn)生的能表達(dá)HIV?gag-pol的載體顆粒會(huì)將這些蛋白質(zhì)導(dǎo)入患者體內(nèi)，從而導(dǎo)致血清轉(zhuǎn)變的風(fēng)險(xiǎn)。為此，需要研制不會(huì)將HIV蛋白質(zhì)導(dǎo)入患者體內(nèi)的基于慢病毒的載體。

現(xiàn)在，我們已發(fā)現(xiàn)可以提供改良的慢病毒載體，該載體克服了基于HIV載體的局限性。在研制任何逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)時(shí)，重要的是從逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中除去可抑制載體轉(zhuǎn)移異源基因能力的序列或可將不利的蛋白質(zhì)編碼序列轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的序列。逆轉(zhuǎn)錄病毒可被有效包裝的RNA序列長(zhǎng)度有限，因此，逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組長(zhǎng)區(qū)域的存在嚴(yán)重限制了載體對(duì)異源編碼RNA的編碼能力。

我們還發(fā)現(xiàn)可以基于非靈長(zhǎng)類動(dòng)物慢病毒提供慢病毒載體，該載體對(duì)異源編碼序列具有高編碼能力，并且將逆轉(zhuǎn)錄病毒的組分轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的能力降低。

我們驚奇地發(fā)現(xiàn)需要從非靈長(zhǎng)類動(dòng)物慢病毒中得到的載體基因組序列的量基本上低于基于HIV的載體所需要的量。

對(duì)包裝HIV載體基因組的序列需求是復(fù)雜的。HIV-1包裝信號(hào)包含剪接供體位點(diǎn)，并含有g(shù)ag基因的5’非翻譯區(qū)域部分，其推定的二級(jí)結(jié)構(gòu)含有4個(gè)短莖-環(huán)。基因組別處的其它序列對(duì)HIV的有效衣殼化也是至關(guān)重要的。例如，有效包裝可歸功于gag蛋白編碼序列的前350個(gè)bp，并且涉及env未完全確定的區(qū)域。為了構(gòu)建能表達(dá)異源基因的HIV載體，使用了延伸至350bp長(zhǎng)的gag蛋白編碼序列的包裝信號(hào)。