[發(fā)明專利]一種重組抗CTLA4單克隆抗體及其制備方法和用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710101490.4
• 申請(qǐng)日: 2007-04-23
• 公開（公告）號(hào): CN101074264A
• 公開（公告）日: 2007-11-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭亞軍;錢衛(wèi)珠;寇庚;候盛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海中信國健藥業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): C07K16/18
• 分類號(hào): C07K16/18;C12N15/13;C12N15/85;G01N33/577;C12P21/08
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及抗體藥物技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種新的重組抗溶細(xì)胞性T細(xì)胞相關(guān)抗原4單克隆抗體，及其制備方法和用途。

背景技術(shù)

T淋巴細(xì)胞的激活需要至少2個(gè)信號(hào)，第一信號(hào)為T細(xì)胞抗原受體(TCR)和抗原提呈細(xì)胞(APC)表面MHC/抗原肽復(fù)合物結(jié)合所產(chǎn)生，這兩種配體的結(jié)合需要特異性識(shí)別，與免疫反應(yīng)的特異性有密切關(guān)系。第二信號(hào)為T細(xì)胞表面的其它輔助分子與抗原提呈細(xì)胞表面的相應(yīng)配體結(jié)合產(chǎn)生，該信號(hào)又稱為共刺激信號(hào)，為抗原非特異性。

T細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞表面參與產(chǎn)生共刺激作用的分子統(tǒng)稱為共刺激分子。目前公認(rèn)最重要的共刺激通路為B7一CD28通路。B7位于抗原提呈細(xì)胞，與T細(xì)胞表面的CD28分子結(jié)合可以產(chǎn)生共刺激。當(dāng)T細(xì)胞激活后，其細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)另一種可與B7結(jié)合的分子——細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(Cytotoxic?TLymphocyte?associate?Antigen-4，CTLA4)，它是維持體內(nèi)T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的負(fù)調(diào)控因子。細(xì)胞內(nèi)CTLA4的表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控。在靜止T細(xì)胞表面檢測(cè)不到該蛋白，只有在T細(xì)胞活化轉(zhuǎn)錄增高時(shí)才可測(cè)到其mRNA。即使是活化的T細(xì)胞，也僅部分T細(xì)胞表面表達(dá)該蛋白。CTLA4與B7的親和力是CD28的500-2500倍。CTLA4分子與B7結(jié)合，可以誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，它是在T細(xì)胞激活后發(fā)揮免疫調(diào)控作用的重要分子。

1991年由Linsley等利用基因工程的方法將細(xì)胞膜表面CTLA4分子與免疫球蛋白Fc片段組合起來，形成一種人工構(gòu)建的融合蛋白分子CTLA4-Fc，它與B7的親和力大大高于CD28，可以封閉APC上的B7，阻斷共刺激通路，抑制T細(xì)胞的激活。

CTLA4-Fc的N-末端含有人CTLA4的細(xì)胞外段，即N-末端的1-125號(hào)氨基酸殘基，隨后是人IgG1的重鏈鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)。上述基因序列裝入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體后，轉(zhuǎn)入動(dòng)物細(xì)胞(如CHO工程細(xì)胞)，可以表達(dá)出DNA序列對(duì)應(yīng)的蛋白分子。由于保留了鉸鏈區(qū)的2個(gè)半胱氨酸殘基，CTLA4-Fc以等二聚體的形式分泌。另外，每條肽鏈上有2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，CTLA4和Ig部分各有1個(gè)。它的分子量大約為97KDa。

CTLA4-Fc的免疫抑制機(jī)理：由于CTLA4-Fc保留了與配體B7結(jié)合的CTLA4膜外區(qū)，它在與表達(dá)有B7分子的抗原提呈細(xì)胞接觸后，可以與B7結(jié)合，從而使T細(xì)胞表面的CD28分子無法與B7結(jié)合。此時(shí)TCR僅接受了來自抗原提呈細(xì)胞MHC的第一信號(hào)，由于沒有輔助信號(hào)的共刺激作用，而造成T細(xì)胞凋亡。在體內(nèi)可以造成該克隆的T細(xì)胞被清除，造成克隆無反應(yīng)性和免疫耐受。但它對(duì)于未受到第一信號(hào)刺激的T淋巴細(xì)胞無影響。相比之下，其它免疫抑制劑往往會(huì)沒有選擇地殺傷所有的T細(xì)胞克隆，造成明顯的全身反應(yīng)和毒副作用。

在CTLA4-Fc進(jìn)行臨床前研究及臨床研究的過程中，以及將來成為藥物后患者應(yīng)用的過程中，均需要檢測(cè)受試者(動(dòng)物或人)或患者的血清CTLA4-Fc濃度，在某些造血系統(tǒng)的惡性疾患中，CTLA4可能會(huì)異常高表達(dá)，因此，在這類患者的診療過程中，也需要檢測(cè)患者血清中CTLA4濃度。所以迫切需要一種能有效、快速檢測(cè)CTLA4-Fc類藥物及CTLA4的產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的需要解決的技術(shù)問題之一是提供一種重組抗溶細(xì)胞性T細(xì)胞相關(guān)抗原4單克隆抗體，該抗體用于體外檢測(cè)CTLA4的濃度。

本發(fā)明需要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種編碼上述抗溶細(xì)胞性T細(xì)胞相關(guān)抗原4單克隆抗體的DNA分子。

本發(fā)明需要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供一種表達(dá)載體。

本發(fā)明需要解決的第四個(gè)技術(shù)問題是提供一種真核宿主細(xì)胞。

本發(fā)明需要解決的第五個(gè)技術(shù)問題是提供一種上述單克隆抗體的用途。

本發(fā)明需要解決的第六個(gè)技術(shù)問題是提供一種該單克隆抗體的制備方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明一方面提供了一種重組的抗溶細(xì)胞性T細(xì)胞相關(guān)抗原4抗體，該抗體含有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其特征在于，輕鏈可變區(qū)具有SEQ?ID?NO:1所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)具有SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列。

本發(fā)明另一方面提供了編碼上述單克隆抗體的DNA分子。該DNA分子含有SEQID?NO:3所示的編碼所述單抗輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，以及SEQIDNO:4所示的編碼所述單抗重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。

本發(fā)明第三方面提供了一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有上述DNA序列以及與該序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。