[發(fā)明專利]電化學(xué)發(fā)光樹狀結(jié)構(gòu)標(biāo)記物及其制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710100704.6
• 申請(qǐng)日: 2007-04-14
• 公開（公告）號(hào): CN101285833A
• 公開（公告）日: 2008-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭良宏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 郭良宏
• 主分類號(hào): G01N33/52
• 分類號(hào): G01N33/52;G01N33/532;C12Q1/68
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及抗原/抗體免疫測(cè)試中使用的標(biāo)記物及其制備方法，特別地，涉及用核酸和電化學(xué)發(fā)光分子的結(jié)合物對(duì)免疫檢測(cè)進(jìn)行多標(biāo)記的方法。

技術(shù)背景

免疫分析方法由于具有高度的特異性、快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，已廣泛的應(yīng)用于生命科學(xué)，藥物分析，臨床診斷及環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域。由于免疫反應(yīng)自身產(chǎn)生的物理變化非常微弱，難于檢測(cè)，通常在抗原或抗體上標(biāo)記產(chǎn)生特異信號(hào)的物質(zhì)或分子，稱為標(biāo)記物。根據(jù)產(chǎn)生信號(hào)的不同，標(biāo)記物可分為放射性同位素、熒光染料、電化學(xué)分子、酶、化學(xué)發(fā)光物、電化學(xué)發(fā)光物等，其中最后兩類標(biāo)記物對(duì)應(yīng)的免疫測(cè)試在目前具有最高的檢測(cè)靈敏度。然而，隨著對(duì)低豐度蛋白檢測(cè)的需求日益迫切，進(jìn)一步提高免疫試驗(yàn)的靈敏度成為研究的熱點(diǎn)。在免疫分析方法中，檢測(cè)靈敏度的提高主要采取兩種手段：一是體外擴(kuò)增低豐度蛋白；一是增加信號(hào)分子的數(shù)量。前者在實(shí)際運(yùn)用中難以實(shí)現(xiàn)，因?yàn)槟壳暗募夹g(shù)條件難以使蛋白質(zhì)像核酸(例如：DNA)那樣，采用多聚酶鏈反應(yīng)在體外擴(kuò)增。因此，增加信號(hào)分子的數(shù)量就成為提高蛋白質(zhì)檢測(cè)靈敏度的主要突破口。在免疫分析過(guò)程中，信號(hào)分子通常是標(biāo)記于抗體或抗原上，如何將更多的信號(hào)分子標(biāo)記于同一個(gè)抗原或抗體上，使檢測(cè)信號(hào)得到增強(qiáng)，同時(shí)不影響抗原或抗體的識(shí)別性能，是最大的難點(diǎn)之一。按照標(biāo)記物和被標(biāo)記蛋白之間聯(lián)結(jié)方式的不同，標(biāo)記方法可分為共價(jià)標(biāo)記和非共價(jià)標(biāo)記兩類。而根據(jù)標(biāo)記物與蛋白聯(lián)結(jié)位點(diǎn)的數(shù)目，又可分為多個(gè)位點(diǎn)標(biāo)記和單個(gè)位點(diǎn)標(biāo)記。一般而言，共價(jià)標(biāo)記的制備難度大于非共價(jià)標(biāo)記，單個(gè)位點(diǎn)標(biāo)記難于多個(gè)位點(diǎn)標(biāo)記。其中單個(gè)位點(diǎn)多標(biāo)記的蛋白標(biāo)記方法由于在一個(gè)蛋白分子上引入了多個(gè)標(biāo)記物，可大幅度地提高檢測(cè)信號(hào)。同時(shí)由于在目標(biāo)蛋白上只涉及單個(gè)聯(lián)結(jié)位點(diǎn)，可最大限度地減少標(biāo)記物對(duì)目標(biāo)蛋白免疫活性的干擾，因此兼顧了免疫測(cè)試的信號(hào)強(qiáng)度和特異性。

采用核酸進(jìn)行免疫測(cè)試標(biāo)記，在專利和科研文章中已有描述或報(bào)道。在美國(guó)專利US4748111(公開日：1988-05-31)中，Dattagupta等人描述了一個(gè)用核酸作為信號(hào)分子載體對(duì)免疫測(cè)試進(jìn)行多標(biāo)記的方法，其中核酸的3’端與免疫測(cè)試的蛋白質(zhì)通過(guò)共價(jià)鍵連接。在美國(guó)專利US4921788(公開日：1990-05-01)中，Deutsch描述了一個(gè)免疫測(cè)試分析物的單鏈核酸類似物，可是該類似物與抗體結(jié)合后，失去了與互補(bǔ)核酸的雜交能力，導(dǎo)致與核酸雙鏈特異性結(jié)合的信號(hào)分子的信號(hào)下降。在美國(guó)專利US6280933(公開日：2001-08-28)中，Glazer等人描述了一個(gè)用雙鏈核酸作為熒光分子載體對(duì)免疫測(cè)試進(jìn)行多標(biāo)記的方法，其中的熒光分子是核酸嵌入劑并帶兩個(gè)正電荷。在美國(guó)專利US6117631(公開日：2000-09-12)中，Nilsen描述了一個(gè)特定的樹枝狀核酸(DNA?dendrimer)對(duì)免疫測(cè)試進(jìn)行多標(biāo)記的方法。另外，在美國(guó)專利US5665539(公開日：1997-09-09)中，Sano等描述了一個(gè)稱為免疫PCR(immuno-PCR)的方法，用核酸對(duì)免疫測(cè)試進(jìn)行標(biāo)記，然后通過(guò)PCR對(duì)核酸標(biāo)記進(jìn)行擴(kuò)增，最后通過(guò)核酸定量進(jìn)行免疫分析。國(guó)內(nèi)目前還沒有這方面的專利。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明主要是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)以下幾個(gè)方面的不足進(jìn)行改進(jìn)：1)為了降低在抗體上標(biāo)記信號(hào)分子的難度，采用非共價(jià)的方式引入信號(hào)分子載體；2)為了實(shí)現(xiàn)單個(gè)位點(diǎn)多標(biāo)記的策略，以核酸為信號(hào)分子載體。簡(jiǎn)言之，即是以核酸為信號(hào)分子載體，通過(guò)核酸的多個(gè)作用位點(diǎn)引入大量的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)分子，搭建一種由核酸/電化學(xué)發(fā)光分子結(jié)合體構(gòu)成的鏈狀標(biāo)記物，用于免疫檢測(cè)。與常規(guī)的免疫測(cè)試比較，本方法提供的標(biāo)記物中的信號(hào)分子不只一個(gè)，而是多個(gè)甚至幾十個(gè)，因此可以大幅度提高檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度，明顯改善檢測(cè)靈敏度。與通過(guò)化學(xué)合成方法制備的有機(jī)聚合物、樹枝狀有機(jī)分子(dendrimer)、無(wú)機(jī)復(fù)合物和無(wú)機(jī)納米標(biāo)記物比較，本方法采用常規(guī)生化和化學(xué)試劑，易于獲得，價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好。

本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種樹狀結(jié)構(gòu)標(biāo)記物，其包含核酸、電化學(xué)發(fā)光分子和蛋白質(zhì)/化合物，其中所述的電化學(xué)發(fā)光分子與作為載體的核酸在多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合形成信號(hào)標(biāo)記物，所述信號(hào)標(biāo)記物與蛋白質(zhì)或化合物以非共價(jià)鍵方式連接，形成樹狀結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了所述樹狀結(jié)構(gòu)標(biāo)記物的制備方法，其包括下列步驟：

(a)提供核酸作為電化學(xué)發(fā)光分子的載體；

(b)將多個(gè)電化學(xué)發(fā)光分子與所述核酸結(jié)合，形成高結(jié)合率的結(jié)合物；和

(c)將所述結(jié)合物作為信號(hào)標(biāo)記物，與蛋白質(zhì)或化合物以非共價(jià)鍵方式聯(lián)結(jié)，用于免疫測(cè)試。