[發明專利]一種C端特異的人YWHAE多肽及其抗體制備方法

無效

• 申請號: 200710100208.0
• 申請日: 2007-06-06
• 公開（公告）號: CN101319003A
• 公開（公告）日: 2008-12-10
• 發明（設計）人: 杜宏武;陳光宇;王德仙;陳吾奇
• 申請（專利權）人: 北京意宏安生物科技有限公司
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K16/18
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及以抗體為特征的體外試驗用的生物制品，具體是一種C端特異的YWHAE多肽及其抗體制備方法，屬于生物醫學技術領域。

背景技術

YWHAE(tyrosine?3/tryptophan?5-monooxygenase?activationprotein)蛋白屬于14-3-3家族，通過結合phosphoserine-containingproteins介導信號轉導。這一高度保守的蛋白家族已被證實存在于植物和哺乳動物。YWHAE可以和CDC25，RAF1以及IRS1蛋白相互作用，提示其可能具有多種生物學功能，并已證明與胰島素代謝相關，與小細胞肺癌相關。

發明內容

本發明是為解決通過免疫實驗特異性檢測YWHAE的表達與天然存在，并建立相應體外免疫分析所需基本生物制品的問題，而提供的一種能特異性針對YWHAE的C端的合成多肽、相應抗體及其制備方法。本發明還可同時解決目前使用的類似抗體價格高，親和力低，抗體結合蛋白的位置不特異且抗原性較差等問題。本發明所述的抗YWHAE合成多肽、相應抗體，按照以下步驟制備：

抗原表位分析與拮抗位置確定：利用多種表位預測軟件，如DNAstar，OMIGA，UWGCG等進行綜合分析，主要考量指標包括親水性結構、抗原指數、表面可及性等，再結合我們已有實際制備抗體的驗證經驗，最終確定第184到第198位為該抗體的靶標，其氨基酸序列為ILNSPDRACRLAKAA。

多肽的合成：靶標多肽采用全自動多通道多肽合成儀合成，柱層析純化，然后通過HPLC，用每分鐘1％的標準乙晴梯度來檢測純度。

多肽與載體蛋白交聯：由于本合成多肽分子量太小，在動物體內不能誘導產生免疫反應，因此將多肽與載體蛋白交聯后才能進行免疫，選擇鑰孔嘁血藍素進行交聯，能顯著增加抗原的大小和免疫原性，從而制備出人工免疫原。

免疫動物：所述的制備方法，其抗原肽-交聯載體蛋白做為免疫原，免疫家兔制備抗體。選取適齡免疫用新西蘭兔，經過適應性飼養后進行多點注射免疫。反復加強免疫，至取血測抗體效價達到標準時停止免疫。

抗體純化：達到要求的免疫動物放血，標準方法收集抗血清，依次使用辛酸-硫酸銨方法和親和層析過柱純化方法，進行抗血清純化，通過SDS-PAGE和HPLC驗證純度，得到目標抗體。

本發明制備的高質量多肽抗體效價高、親和力強，可與天然YWHAE分子發生特異性結合反應。用多肽制備抗體的成本較常規的重組抗原制備抗體方法低，抗體特異性好，經親和層析純化后可以用于各種酶免檢測和WB試驗要求，可用于建立體外免疫分析。該合成肽抗體的制備，為YWHAE分子的研究及其相關疾病的研究(如診斷策略的制定，流行病學調查、預防和控制)提供了一個重要的工具，以及在生物醫學研究中對相應靶蛋白的特性、含量的測定、分布情況的分析和蛋白的確證等方面都具有重要作用。

附圖說明

圖1是液相色譜鑒定合成多肽純度結果圖。

圖2是質譜鑒定合成多肽分子量結果圖。

圖3是通過間接ELISA方法鑒定純化抗體相對親和常數結果圖。

圖1表明經過HPLC對合成的多肽進行純化后，液相色譜鑒定純度為81.1％。

圖2表明多肽分子量理論值為1700.1，質譜鑒定實測值【M+H⁺】為1702.4。

圖3中ELISA檢測制備的多抗和多肽抗原親和常數為10⁶-10⁷L/mol。

具體實施方式

實施例1：YWHAE抗原肽的合成。

用DNAstar，OMIGA，UWGCG等蛋白分析軟件，對YWHAE氨基酸序列進行親水性結構(hydrophilicity)、抗原指數(antigenicity)、表面可及性(surface?probability)以及同源性等分析(homology)，再結合我們已有實際制備抗體的驗證經驗，最終確定第184到第198位為靶標，其氨基酸序列為ILNSPDRACRLAKAA。在全自動多肽合成儀上由固定羧基向氨基端遞減合成后獲得粗品。經30％乙睛溶解后，進行高壓液相色譜(HPLC)分析，計算主峰面積并收集，經冷凍真空抽干后純化合成肽，質譜鑒定。

實施例2：合成多肽與載體的偶聯。