[發(fā)明專利]一種C端特異的人Eme1多肽及其抗體制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710100198.0
• 申請(qǐng)日: 2007-06-06
• 公開（公告）號(hào): CN101318998A
• 公開（公告）日: 2008-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳光宇;杜宏武;王德仙;陳吾奇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京意宏安生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C07K7/08
• 分類號(hào): C07K7/08;C07K16/18
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及以抗體為特征的體外試驗(yàn)用的生物制品，具體是一種C端特異的人Eme1多肽及其抗體制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

Eme1(essential?meiotic?endonuclease?1?homolog?1)蛋白與Mus81復(fù)合在一起即構(gòu)成了能切割有分支DNA結(jié)構(gòu)的外切核酸酶。研究表明，敲除了Eme1基因的胚胎干細(xì)胞對(duì)絲裂霉素C等DNA交聯(lián)劑高度敏感，對(duì)離子輻射、UV輻射以及羥基脲處理敏感性稍弱。此外，研究結(jié)果還顯示Eme1在哺乳動(dòng)物基因組完整性的維持和DNA修復(fù)過程中發(fā)揮了非常關(guān)鍵的作用，其缺陷可導(dǎo)致自發(fā)的基因組不穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是為解決通過免疫實(shí)驗(yàn)特異性檢測(cè)Eme1的表達(dá)與天然存在，并建立相應(yīng)體外免疫分析所需基本生物制品的問題，而提供的一種能特異性針對(duì)Eme1的C端合成多肽抗體及其制備方法。本發(fā)明還可同時(shí)解決目前使用的類似抗體價(jià)格高，親和力低，抗體結(jié)合蛋白的位置不特異且抗原性較差等問題。本發(fā)明所述的抗Eme1合成多肽抗體，按照以下步驟制備：

抗原表位分析與拮抗位置確定：利用多種表位預(yù)測(cè)軟件，如DNAstar，OM?IGA，UWGCG等進(jìn)行綜合分析，主要考量指標(biāo)包括親水性結(jié)構(gòu)、抗原指數(shù)、表面可及性等，再結(jié)合我們已有實(shí)際制備抗體的驗(yàn)證經(jīng)驗(yàn)，最終確定第532到第546位為該抗體的靶標(biāo)，其氨基酸序列為VRRGEGVTSTSRRIG。

多肽的合成：靶標(biāo)多肽采用全自動(dòng)多通道多肽合成儀合成，柱層析純化，然后通過HPLC，用每分鐘1％的標(biāo)準(zhǔn)乙晴梯度來檢測(cè)純度。

多肽與載體蛋白交聯(lián)：由于本合成多肽分子量太小，在動(dòng)物體內(nèi)不能誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，因此將多肽與載體蛋白交聯(lián)后才能進(jìn)行免疫，選擇鑰孔嘁血藍(lán)素進(jìn)行交聯(lián)，能顯著增加抗原的大小和免疫原性，從而制備出人工免疫原。

免疫動(dòng)物：所述的制備方法，其抗原肽-交聯(lián)載體蛋白做為免疫原，免疫家兔制備抗體。選取適齡免疫用新西蘭兔，經(jīng)過適應(yīng)性飼養(yǎng)后進(jìn)行多點(diǎn)注射免疫。反復(fù)加強(qiáng)免疫，至取血測(cè)抗體效價(jià)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)時(shí)停止免疫。

抗體純化：達(dá)到要求的免疫動(dòng)物放血，標(biāo)準(zhǔn)方法收集抗血清，依次使用辛酸-硫酸銨方法和親和層析過柱純化方法，進(jìn)行抗血清純化，通過SDS-PAGE和HPLC驗(yàn)證純度，得到目標(biāo)抗體。

本發(fā)明制備的高質(zhì)量多肽抗體效價(jià)高、親和力強(qiáng)，可與天然Eme1分子發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。用多肽制備抗體的成本較常規(guī)的重組抗原制備抗體方法低，抗體特異性好，經(jīng)親和層析純化后可以用于各種酶免檢測(cè)和WB試驗(yàn)要求，可用于建立體外免疫分析。該合成肽抗體的制備，為Eme1分子的研究及其相關(guān)疾病的研究(如診斷策略的制定，流行病學(xué)調(diào)查、預(yù)防和控制)提供了一個(gè)重要的工具，以及在生物醫(yī)學(xué)研究中對(duì)相應(yīng)靶蛋白的特性、含量測(cè)定、分布情況的分析和蛋白的確證等方面都具有重要作用。

附圖說明

圖1是液相色譜鑒定合成多肽純度結(jié)果圖。

圖2是質(zhì)譜鑒定合成多肽分子量結(jié)果圖。

圖3是通過間接ELISA方法鑒定純化抗體相對(duì)親和常數(shù)結(jié)果圖。

圖1表明經(jīng)過HPLC對(duì)合成的多肽進(jìn)行純化后，液相色譜鑒定純度為94.8％。

圖2表明多肽分子量理論值為1733，質(zhì)譜鑒定實(shí)測(cè)值【M+H⁺】為1734.4。

圖3中ELISA檢測(cè)制備的多抗和多肽抗原親和常數(shù)為10⁹-10¹⁰L/mol。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：Eme1抗原肽的合成。

用DNAstar，OMIGA，UWGCG等蛋白分析軟件，對(duì)Eme1氨基酸序列進(jìn)行親水性結(jié)構(gòu)(hydrophilicity)、抗原指數(shù)(antigenicity)、表面可及性(surface?probability)以及同源性(homology)等分析，再結(jié)合我們已有實(shí)際制備抗體的驗(yàn)證經(jīng)驗(yàn)，最終確定第532到第546位為靶標(biāo)，其氨基酸序列為VRRGEGVTSTSRRIG。在全自動(dòng)多肽合成儀上由固定羧基向氨基端遞減合成后獲得粗品。經(jīng)30％乙睛溶解后，進(jìn)行高壓液相色譜(HPLC)分析，計(jì)算主峰面積并收集，經(jīng)冷凍真空抽干后純化合成肽，質(zhì)譜鑒定。

實(shí)施例2：合成多肽與載體的偶聯(lián)。