[發(fā)明專利]從亞油酸異構酶產生菌中提取純化亞油酸異構酶的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710099653.X
• 申請日: 2007-05-25
• 公開（公告）號: CN101092613A
• 公開（公告）日: 2007-12-26
• 發(fā)明（設計）人: 呂加平;王麗敏;任星環(huán);江均平
• 申請（專利權）人: 中國農業(yè)科學院農產品加工研究所
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12P7/64
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發(fā)明涉及一種從亞油酸異構酶產生菌中提取純化亞油酸異構酶的方法。

背景技術

共軛亞油酸(Conjugated?Linoleic?Acid，CLA)是一種非常令人感興趣的營養(yǎng)添加劑，大量的體內體外試驗證明CLA能誘導能量利用并導致體重的下降，且不儲存脂肪；能緩和如厭食、蛋白質分解等免疫反應的副作用；具有抗突變、抑制癌細胞中的蛋白質和核酸的合成，此外CLA還可提高人類某些生理狀態(tài)，如提高體內維生素A的水平。由于CLA具有豐富的營養(yǎng)價值，同時食品中含量很低，所以如何低成本、高純度地制備CLA成為研究焦點，CLA的商業(yè)化生產方法為亞油酸的堿異構化法。堿異構化法的原料是含有77％亞油酸的葵花籽油，經(jīng)過KOH(或NaOH)強堿的作用轉化成CLA，這種方法比較簡單，且產物易于處理，在商業(yè)上應用較廣，但其缺點是產生一系列具有位置和幾何異構的CLA混合物。相比之下，利用乳酸菌中提取的亞油酸異構酶生產CLA具有重要意義。因為CLA的微生物異構化具有選擇性，其亞油酸異構酶能專一地作用于脂肪酸的12C雙鍵，而不是9C雙鍵，因而能把亞油酸主要轉化為c9，t11-CLA，而且微生物在培養(yǎng)方面較為靈活、方便。而乳酸菌兼性厭氧，培養(yǎng)條件易于控制，是人體益生菌，可直接用于食品、保健品和藥品。同時乳酸菌含有的亞油酸異構酶對作用底物具有很強的專一性。

亞油酸異構酶可來源于多種微生物如乳酸桿菌(Lactobacillus)、丁酸弧菌(Butyrivibrio)、丙酸桿菌(Propionibacterium)、真桿菌屬(Eubacterium)等，其中Lactobacillus、Eubacterium、Butyrivibrio的微生物具有c9，t11亞油酸異構酶的活性，而Propionibacterium有t10，c12亞油酸異構酶的活性。

公開號為1289758、1415718和1356386的中國專利文獻介紹了用化學異構法生產CLA的方法，原料主要為富含亞油酸的紅花油、脫水蓖麻油、鹽地堿蓬籽油等，在強堿環(huán)境中發(fā)生共軛化反應。雖然工藝簡單，對設備要求低，但產物中含有大量有毒溶劑，異構體組成復雜，下游提取純化工藝復雜，因此應用于食品與藥品行業(yè)存在一定局限性。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種從亞油酸異構酶產生菌中提取純化亞油酸異構酶的方法。

本發(fā)明所提供的從亞油酸異構酶產生菌中提取純化亞油酸異構酶的方法，包括以下步驟：

1)用超高壓均質法破碎亞油酸異構酶產生菌的菌體細胞，得到均質液，將該均質液進行離心，收集含有蛋白質的上清液得到粗酶液；

所述超高壓均質法的均質工作壓力為130-160MPa，均質閥片直徑為0.05-0.15mm；

2)將步驟1)得到的粗酶液進行(NH₄)₂SO₄飽和度為40-90％的(NH₄)₂SO₄分級沉淀，收集沉淀，用磷酸鉀緩沖液懸浮，得到酶液；所述磷酸鉀緩沖液的摩爾濃度為0.08-0.15mol/L、pH為5.5-7.0；

3)將步驟2)得到的酶液進行離子交換層析，所述離子交換層析采用pH為5.5-7.0、摩爾濃度為0-0.7mol/L的NaCl溶液進行線性洗脫，收集具有亞油酸異構酶活性的洗脫峰酶液；

4)將步驟3)得到的具有亞油酸異構酶活性的洗脫峰酶液用摩爾濃度為0.08-0.15mol/L、pH為5.5-7.0的磷酸鉀緩沖液進行透析脫鹽；

5)將經(jīng)過步驟4)透析的酶液凝膠過濾層析；所述凝膠過濾層析中采用的洗脫液為摩爾濃度為0.08-0.15mol/L、pH為5.5-7.0的磷酸鉀緩沖液，得到亞油酸異構酶。

所述超高壓均質法中的細胞的含量可為10⁸-10¹⁴CFU/ml，優(yōu)選為10¹⁰-10¹²CFU/ml。

所述凝膠過濾層析采用的凝膠層析柱可為Sephacryl?200HR、也可采用其它分子量范圍與上述填料相近似的層析柱如Sephadex。

所述離子交換層析采用的層析柱可為DEAE-Sepharose?Fast?Flow層析柱，也可可采用其它的弱陰離子交換層析柱。

所述(NH₄)₂SO₄的飽和度具體可為60％、80％或90％。