[發明專利]內置微孔濾膜的連通式微生物培養裝置及其培養方法

無效

• 申請號: 200710099489.2
• 申請日: 2007-05-23
• 公開（公告）號: CN101109006A
• 公開（公告）日: 2008-01-23
• 發明（設計）人: 吳曉磊;郭斌;余素林
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12M3/06
• 分類號: C12M3/06
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司
• 代理人: 李光松

技術領域

本發明屬于微生物的實驗室培養技術，涉及一種內置微孔濾膜的連通式微生物培養裝置及其培養方法。具體說，涉及提高微生物可培養性的新型的微生物培養裝置的設計以及利用固體或半固體培養基對環境微生物進行培養、分離純化以及觀察的技術。

背景技術

長期以來，人們利用純培養技術對環境中的微生物進行調查研究和開發利用。但是，研究表明自然界中絕大多數微生物尚不能被目前的純培養技術所培養。主要原因是培養微生物的培養介質與微生物實際所在環境的介質差別很大，導致微生物在實驗室中無法生長繁殖。具體表現為：

(1)采用偏離實際環境的高濃度營養培養基；

(2)培養基中缺乏微生物生長繁殖所必須的微量化學物質；

(3)忽視環境中各種微生物的相互影響，這包括微生物種間的偏利共生關系(Commersalism)和互惠共生關系(Mutualism)以及群落之間的群體感應(Quorum?sensing)。

基于對以上微生物不可培養原因的認識，人們開始嘗試多種方法試圖培養原本不可培養的微生物。

有些學者在保留常規培養方法所使用的傳統培養皿的基礎上，改進了部分培養措施使得更多的微生物得到培養。例如，在培養基中加入過氧化氫降解物質或抗氧化劑以減少微生物代謝產生的毒性氧；加入微生物相互作用的信號分子以模擬微生物間的相互作用；以及供應新型的電子供體和受體等。盡管以上種種方法能夠適當增加微生物的可培養性，但是這些添加物質的選定往往無法準確地反映自然環境中的全部情況，不能很好地解決常規培養方法的主要缺陷一難以模擬自然環境的真實狀態，結果費時費力且改進效果不顯著。

另一些學者完全摒棄常規培養裝置和方法，改用新型的培養裝置并開發新型的培養技術，試圖從根本上解決常規培養方法的局限性，結果獲得了較為顯著的效果。

Button(1993)從概率論的角度提出一個嶄新的方法-稀釋培養法(Dilutionculture)，認為當把海水中微生物群體稀釋至痕量時，在海水中主要存在的寡營養微生物可以不受少數幾種優勢微生物的競爭作用，因而主體寡營養微生物被培養的可能性會大大提高。隨后，Schut(1993)等的實際操作驗證了該理論的正確性。Connon(1992)在稀釋培養法的基礎上提出高通量培養法(High-throughputculturing)。將樣品稀釋至痕量后，采用小體積48孔細胞培養板分離培養微生物。該方法不僅提高微生物的可培養性，還可在短期內監測大量的培養物，大大提高了工作效率。但是，稀釋培養法和高通量培養法沒有考慮模擬原有的環境條件，也沒有考慮微生物之間的相互關聯，致使當微生物極度稀釋、初始接種量很小時，一些微生物與其他關聯微生物之間的聯系被削略，很多微生物仍然不可培養。

此外，Zengler等(2002)將海水和土壤樣品中的微生物先進行類似稀釋培養法的稀釋過程，然后乳化，部分微生物形成了僅含單個細胞的膠狀微滴。然后將膠狀微滴裝入層析柱內，使培養液連續通過層析柱進行流態培養。層析柱進口端用0.1μm濾膜封住，防止細菌的進入而污染層析柱；出口端用8μm濾膜封住，允許培養產生的細胞隨培養液流出。該方法的特點是讓微生物在開放式培養液中生長，使培養環境接近于微生物的自然生長環境，能夠很好地提高微生物可培養性，但是成本較高，不利于普及使用。

值得關注的是，一個首創性的微生物培養裝置發表于2002年的Science期刊上，由Kaeberlein等設計用于培養潮間帶底泥中的微生物，起名為擴散盒(Diffusion?growth?chamber)。擴散盒由一個環狀的不銹鋼墊圈和兩側膠連的0.1um濾膜組成，濾膜只能允許培養環境中的化學物質通過而不能讓細胞通過。將底泥樣品置于盒內的半固體培養基中，擴散盒放在置于魚缸底部的天然海洋底泥上，往魚缸內加入天然海水并保證擴散盒內存有一定空氣供微生物生長。培養時，使天然海水循環流動，并不斷注入新鮮的海水。培養1周后培養基上產生大量的微型菌落，數目高達接種微生物的40％。該方法相比于前述的各種方法，能較大程度地模擬微生物所處的自然環境。然而，擴散盒法只是對一種新型的培養裝置及其方法的嘗試，由于在培養過程中每個擴散盒均需手工用微孔濾膜封閉，致使操作繁瑣，且不宜大規模的工業化生產，嚴重限制其市場化推廣使用。