[發明專利]人乙酰肝素酶的小分子多肽抑制劑

無效

• 申請號: 200710099447.9
• 申請日: 2007-05-21
• 公開（公告）號: CN101311188A
• 公開（公告）日: 2008-11-26
• 發明（設計）人: 劉剛;程慧君;陳惠鵬;湯國營;戴紅梅
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C07K7/64;C12N15/12;A61K47/42;A61P35/00;A61K38/08;A61K38/12
• 代理公司: 北京北新智誠知識產權代理有限公司
• 代理人: 李超

技術領域

本發明涉及一種人乙酰肝素酶的小分子多肽抑制劑及其在腫瘤治療中的應用，屬于生物醫學領域。?

背景技術

腫瘤的侵潤和轉移是導致腫瘤患者死亡的主要原因。癌細胞的轉移需要突破胞外基質及圍繞血管的基底膜等屏障，這些屏障主要是由一類硫酸乙酰肝素碳水化合物的纖維網絡中包埋的蛋白質構成。乙酰肝素酶(heparanase，HPA)正是參與細胞外基質及基底膜降解而幫助癌細胞轉移的關鍵酶。HPA在腫瘤轉移中的作用可概括如下：(1)降解胞外基質和基底膜，破壞細胞侵襲的屏障；(2)降解內皮基底膜，促進新生血管生成；(3)釋放結合在HS側鏈上的生長因子，促進腫瘤細胞生長。?

HPA是裂解胞外基質(extracellular?matrix，ECM)和細胞基底膜(basementmembrane，BM)中乙酰硫酸肝素鹽蛋白聚糖(heparin?sulphate?proteoglycan，HSPG)上的硫酸乙酰肝素鹽(heparin?sulphate，HS)側鏈的內源葡萄糖醛酸酶的統稱。HSPGs由一個蛋白核心通過共價鍵與HS結合組成的糖氨聚糖，是細胞的自身結構、不溶性的細胞外基質成分以及細胞的粘附、運動所必不可少的重要成分。HS與胞外基質中的大分子，如膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白均有作用，且在細胞膜上有不同的結合位點。HPA的作用就是切割HS側鏈導致細胞基底膜和胞外基質的降解，解除腫瘤細胞侵襲的屏障；并從胞外基質釋放HS結合型活性堿性成纖維生長因子(bEGF)，促進腫瘤新生血管的生成，為腫瘤的生長轉移提供非常便利的物質基礎和通道；此外還可能促進組織特異性生長因子的釋放，參與腫瘤細胞轉移和器官組織特異性的選擇。?

HPA的表達與腫瘤細胞轉移潛能密切相關。實驗證明，無轉移性的乳腺癌細胞MCF-7不具有乙酰肝素酶活性，中度和高轉移性的乳腺癌細胞MDA231、MDA435s分別具有中度和高度的HPA活性。高轉移性的鼠T淋巴瘤細胞Esb具有很高的HPA活性，而無轉移性Esb細胞則不具有HPA活性，Esb細胞轉染了HPA基因后表現出很高的HPA活性，將其注射到DAB/2小鼠中，可使其出現肝和肺的廣泛轉移，生存率明顯降低，這提供了HPA促進腫瘤轉移的直接證據。另有報道腫瘤病人的血清、尿液中HPA活性增高，這對腫瘤轉移的早期診斷、藥物效果及預后預測具有重要的意義。

目前已發現多種HPA的抑制劑，Parish報道用磷酸甘露戊糖硫酸酯(PI-88)處理乳腺癌細胞株13762MAT后注入大鼠能使其肺癌形成率降低90％，還能將原發性腫瘤的血管供應降低30％，使其生長降低一半。該藥已成功完成I期臨床試驗，當前正試用于腫瘤患者的治療。其他抑制劑還有硫酸昆布多糖(sulfated?laminarin)、硫酸殼多糖、SdC28、Ca2SP、蘇拉明等，但由于分子大小、毒性、不均一性結構以及多重生物學效應等原因導致它們不能應用于臨床。因此，特異性已成為設計和尋找HPA抑制劑的關鍵。?

目前，大多數學者認為，在HPA翻譯后加工過程中，N端信號肽(Met1-Ala35)被切除，形成HPA酶原前體；在酶原激活過程中，特異性蛋白水解酶將第110-157位氨基酸組成的6kD肽鏈從前體蛋白中切割下來，余下N-端的8kD小亞基(Gln36-Glu109)與C-端的50kD大亞基(Lys158-Ile543)以非共價鍵結合形成異源二聚體，成為有活性的成熟蛋白。Zetser等應用HPA?C-端大亞基單抗，僅部分抑制HPA的活性，并據此認為N-端8kD小亞基參與構成酶活性中心。McKenzie等構建表達了一系列HPA蛋白缺失體，確定了N-端8kD小亞基的存在對HPA酶活性是必需的。?

噬菌體展示隨機多肽庫技術以噬菌體表面展示(phage?display)技術為基礎，即將外源蛋白或多肽的基因克隆到絲狀噬菌體基因組中，與噬菌體外膜蛋白融合表達，展示在噬菌體顆粒表面，可保持相對獨立的空間構象和生物活性。目前這種技術已廣泛用于抗原表位分析、分子間相互識別、新型疫苗及藥物開發等多個方面。這項技術通過“吸附-洗脫-擴增”多輪親和篩選過程，可以將展示特異性外源肽的噬菌體從噬菌體庫中篩選出來，經多輪篩選擴增可以富集10³——10⁸倍，因此很容易對所篩選的克隆進行基因序列測定，最終確定展示外源肽的氨基酸序列。?

發明內容

本發明要解決的技術問題是：利用噬菌體展示隨機多肽庫技術，以人HPA小亞基為靶標，篩選具有HPA抑制活性的小分子多肽，并用于腫瘤的治療，或作為先導化合物設計HPA特異性抑制劑。?