[發(fā)明專利]一種卵母細(xì)胞石蠟切片的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710098623.7
• 申請日: 2007-04-23
• 公開（公告）號: CN101144760A
• 公開（公告）日: 2008-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李贊東;蔣斌;杜美紅;韓海棠;趙晨
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N33/48
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 張慶敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種石蠟切片的制備方法，具體地說是一種卵母細(xì)胞石蠟切片的制備方法，本發(fā)明方法特別適用于禽類卵巢細(xì)胞切片的制備。

背景技術(shù)

免疫組織化學(xué)(Immunochistochemistry)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)是指運(yùn)用免疫學(xué)原理，通過特異的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，并對抗體標(biāo)記上可見的顯色物來檢查細(xì)胞及組織上原位抗原或抗體成分的方法。可以識別定位細(xì)胞中的各種組織成分，如酶、多肽、核酸、多糖、激素等，最后通過特異性染色可以在光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下觀察其所在細(xì)胞中準(zhǔn)確位置，利用細(xì)胞分光光度計(jì)、圖像分析儀可對檢測物進(jìn)行細(xì)胞的原位定量測定。免疫組織化學(xué)技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、定位準(zhǔn)確并且簡便快速，能夠有機(jī)的同形態(tài)、功能及代謝的研究結(jié)合起來，適合具體研究組織和細(xì)胞中的一些理化因子的分布和功能。免疫組化檢測通常需要先對樣本進(jìn)行包埋制片處理，如石蠟切片，冰凍切片等。在樣本切片上進(jìn)行理化因子的免疫學(xué)檢測。

生物顯微制片技術(shù)是研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)與組織化學(xué)的主要方法，而石蠟切片的制作是組織學(xué)和病理學(xué)中最常用的一種方法，適合于免疫組化檢測的樣本石蠟切片組織平面平整，厚薄適當(dāng)，完整地保留組織的結(jié)構(gòu)形態(tài)，染色效果好，反差強(qiáng)，并且可以長時(shí)間的保存。隨著細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展和體外培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步，通過細(xì)胞培養(yǎng)研究卵母細(xì)胞的生長發(fā)育愈漸深入，對于卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)尤其是關(guān)于其生長發(fā)育過程中的一些基因表達(dá)的產(chǎn)物和調(diào)控激素類物質(zhì)的作用更是人們研究的熱點(diǎn)之一，以往關(guān)于卵母細(xì)胞的發(fā)育研究通常采用卵巢局部組織切片來獲得卵母細(xì)胞的生長發(fā)育信息，對局部卵巢組織進(jìn)行切片優(yōu)點(diǎn)是一張切片中可以包含很多處于不同發(fā)育時(shí)期的卵母細(xì)胞，缺點(diǎn)是由于其中除含有卵母細(xì)胞外還有疏松結(jié)締組織等其它成分，在樣本的脫水過程中由于其所含多種組織性質(zhì)的不均一，導(dǎo)致縮水程度不一致，最后卵母細(xì)胞發(fā)生形變，無法保持其原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)；并且在免疫組化檢測中會消耗大量昂貴的抗體，不僅不能使卵母細(xì)胞的特異性檢測效果增強(qiáng)反而會導(dǎo)致非卵母細(xì)胞特異性染色的發(fā)生，增加背景干擾程度。如果要研究某個重要調(diào)控因子在雌性家禽卵母細(xì)胞中的作用，運(yùn)用卵巢切片的方法還必須在不同時(shí)期殺死多只雌禽取樣，這樣不僅耗時(shí)耗力成本加大，周期延長，而且個體針對性不強(qiáng)，檢測的準(zhǔn)確性不高，置信區(qū)間變寬。

現(xiàn)在細(xì)胞體外培養(yǎng)的技術(shù)和條件均已成熟和完善，雌禽卵巢上卵母細(xì)胞的分離培養(yǎng)技術(shù)也已建立，一只雌禽卵巢上分離的卵母細(xì)胞在體外就可以培養(yǎng)到不同的發(fā)育階段，因此越來越多的學(xué)者投向?qū)仪萋涯讣?xì)胞體外培養(yǎng)過程的研究，體外分離得到或經(jīng)體外培養(yǎng)的家禽卵母細(xì)胞的初期直徑通常小于400μm，石蠟包埋切片前的酒精脫水和二甲苯透明等復(fù)雜工序極易造成卵母細(xì)胞的結(jié)構(gòu)破壞和丟失，所以廣泛用于卵巢組織切片的常規(guī)石蠟包埋制片的方法，并不適合于少量甚至單個卵母細(xì)胞的切片制作，這為利用生物顯微制片技術(shù)來對卵母細(xì)胞發(fā)育過程中的形態(tài)觀察及一些理化因子的免疫組化檢測帶來不便。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對上述不足提供一種卵母細(xì)胞石蠟切片的制備方法，用于對微小卵母細(xì)胞樣本制備石蠟切片，本發(fā)明方法特別適用于制備禽類卵母細(xì)胞切片。

本發(fā)明方法包括如下步驟：

1、固定：將卵母細(xì)胞樣本用吸管轉(zhuǎn)移到含有固定液的無色透明器皿中固定過夜，所述的固定液有10％的甲醛溶液、80-95％的乙醇溶液或5％醋酸溶液；

2、脫水及透明處理：用移液槍將卵母細(xì)胞從固定液中吸出，經(jīng)脫水后，用移液槍將脫水后的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有透明處理液的無色透明器皿中進(jìn)行透明處理，所述的透明處理液為二甲苯、苯、甲苯或氯仿；

3、包埋及切片：將透明處理后的卵母細(xì)胞用移液槍轉(zhuǎn)移到模盒中，去除透明處理液，露出卵母細(xì)胞，在卵母細(xì)胞周圍點(diǎn)上有色染料，經(jīng)石蠟包埋后切片。

本發(fā)明中的卵母細(xì)胞可以是從母體卵巢中中直接分離的卵母細(xì)胞也可以是經(jīng)體外培養(yǎng)獲得的卵母細(xì)胞；所用的透明器皿可以是玻璃器皿；可以用不同濃度梯度的酒精逐級脫水，具體可采用75％，85％，95％以及100％的酒精逐級脫水，每個梯度處理1小時(shí)；透明處理以1小時(shí)為宜；卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到模盒后，可以讓透明處理液適當(dāng)揮發(fā)或?qū)⑵湮觯冻雎涯讣?xì)胞，以便觀察和操作；所用的染料可以是伊紅、品紅、番紅或次甲紫等不與石蠟反應(yīng)的染料；可用常規(guī)程序包埋和切片。