[發(fā)明專利]嘌呤核苷磷酸化酶、腺苷脫氨酶、5’核苷酸酶的聯(lián)合生產(chǎn)工藝

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710098306.5
• 申請日: 2007-04-19
• 公開（公告）號: CN101289646A
• 公開（公告）日: 2008-10-22
• 發(fā)明（設計）人: （請求不公開姓名）
• 申請（專利權）人: 北京邁迪卡科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/12;C12Q1/48;C12N9/22
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種嘌呤核苷磷酸化酶的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征如下：

1)將保藏號為ACCC10741的芽孢桿菌接在LB固體培養(yǎng)基上，LB固體培養(yǎng)基的成分有蛋白胨、酵母粉、NaCl、瓊脂、pH值為7.0-7.2、在高壓滅菌鍋中120℃，0.15MPa滅菌20分鐘，30℃培養(yǎng)15-24小時長出單菌落；

2)將單菌落轉接到種子罐擴大培養(yǎng)，罐中培養(yǎng)基成分有一定的碳、氮配比的蛋白胨與酵母粉、NaCl、MgSO₄、KH₂PO4，K₂HPO₄，pH值為7.0-7.2，在高壓滅菌鍋中120℃、0.15MPa滅菌20分鐘；在30℃和不斷攪拌通氧條件下培養(yǎng)，取樣在紫外分光光度計上測定600nm的吸光度值，OD₆₀₀達到0.8～1.2之間進行下一步驟；

3)按照1～5％的接種量轉接到發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基成分包括一定量的葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、尿素、NaNO₃，NaCl、MgSO₄、KH₂PO₄，K₂HPO₄以及誘導物肌苷，培養(yǎng)條件同步驟2，培養(yǎng)時間18-26個小時，600nm的吸光度值在15～18之間結束發(fā)酵；

4)發(fā)酵后的發(fā)酵液按照常規(guī)方法得到菌體，使用0.1倍發(fā)酵液體積的磷酸鉀緩沖液重懸菌體，加入溶菌酶，37℃溫育1-2h，其中磷酸鉀緩沖液的濃度為20-50mM，pH值為6.8-7.8，溶菌酶的終濃度為10～150mg/ml；

5)使用高壓細胞破碎儀破碎細菌，4度下10000rpm離心20min去除菌體，得到胞內(nèi)粗酶液；

6)在粗酶液中加入硫酸鏈霉素或者硫酸魚精蛋白去除核酸雜質(zhì)，離心步驟同步驟5)，使用硫酸銨進行初步分離，離心得到沉淀，復溶；

7)采取離子交換或者疏水層析使腺苷脫氨酶從復溶液中分離，得到腺苷脫氨酶，使用凝膠過濾收集第一峰得到5’核苷酸酶，收集第二峰得到嘌呤核苷磷酸化酶；

8)通過冷凍干燥最終得到終產(chǎn)品，產(chǎn)品成白色粉末狀，在此過程中需要加入凍干保護劑，在-20℃保存可以穩(wěn)定12個月。