[發明專利]丙型肝炎病毒體外復制模型及其構建方法與應用

無效

• 申請號: 200710097296.3
• 申請日: 2007-04-30
• 公開（公告）號: CN101298605A
• 公開（公告）日: 2008-11-05
• 發明（設計）人: 周亞偉;王玉梅
• 申請（專利權）人: 周亞偉
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06;C12N5/08
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及丙型肝炎病毒體外復制模型及其構建方法與應用，屬于病毒學技術及醫藥生物技術領域。

背景技術

丙型肝炎病毒(Hepatitis?C?Virus，簡稱：HCV)是單股正鏈RNA病毒，屬黃病毒家族。HCV引起的丙型肝炎是一種嚴重威脅人類健康的傳染病，全球統計有1.7億人受到感染，而且每年新增300～400萬例患者。由于HCV容易變異，迄今還沒有疫苗問世，這使得丙型肝炎的危害從某種意義上說比乙肝更為嚴重。

現有技術中，丙型肝炎病毒基因組長約9.6kb，由相對較長的5’NCR(341nt)、一個大的開放讀碼框、較短的3’NCR及polyA或polyU構成。HCV的5’NCR在所有HCV分離株中是最保守的區域，屬非編碼區，含有內在IRES，它可能介導多聚蛋白前體的帽非依賴性翻譯，屬調控單位；同屬非編碼區的3’NCR對HCV的復制起重要作用。編碼區含有結構蛋白和非結構蛋白，僅有一個起始密碼子，翻譯成一個多聚蛋白前體，由病毒和宿主的酶分別對該蛋白進行切割；其中，來自宿主的酶切割ns3編碼的NS3病毒酶類，再由病毒酶類對其它蛋白進行切割；ns5b基因編碼病毒的NS5B蛋白，具有RdRp活性，是HCV復制的關鍵酶。HCV在細胞內的復制是以正鏈為模板復制出其中間體負鏈，再以負鏈為模板復制出其正鏈，因此HCV負鏈的存在是HCV復制的標志。

現有技術中，HCV在被感染組織和血清中濃度較低，長期以來缺乏合適的細胞培養系統和實用的動物模型。

HCV體外感染細胞模型對于深入認識HCV病原學特點、病毒復制機制及致病機理、HCV保護性抗原的鑒定、疫苗研制及特異性抗HCV藥物篩選等是極為重要的工具。為此，國內外學者作了大量探索，主要有HCV感染細胞模型和HCV轉基因細胞模型兩大類。HCV是一種嗜肝性病毒，人們首先選用肝源性細胞來建立模型；此外，臨床上發現HCV還可以侵犯肝外組織如外周血細胞、腎細胞、精子細胞等。但這些HCV復制模型中，普遍存在復制率低、周期長、不能用常規核酸雜交技術檢測病毒復制，而僅靠RT-PCR測定正、負鏈的合成。另外，人們試圖加強復制采用基因轉染的方法構建的HCV復制模型大都沒有肯定的病毒顆粒形成。因此提高HCV在體外培養細胞中的感染率，尤其獲得能夠傳代培養的適應體外細胞培養的毒株，為HCV復制機制、藥物篩選和疫苗研制提供接近自然感染狀態的理想細胞模型是本領域內研究人員急需解決的課題之一。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種接近自然感染狀態的丙型肝炎病毒體外復制模型。

本發明提供的丙型肝炎病毒體外復制模型，是感染了人丙型肝炎病毒的體外培養細胞，其中的丙型肝炎病毒來自丙型肝炎患者血清。該丙型肝炎病毒體外復制模型是人丙型肝炎病毒多次在宿主細胞上活化、傳代而獲得的具有較高復制率的感染細胞。所述宿主細胞為哺乳類細胞，包括肝源細胞、淋巴源細胞、腎源細胞、精子細胞等。其中優選宿主細胞為腎源細胞、肝源細胞、淋巴源細胞。

本發明的另一個目的在于提供一種構建丙型肝炎病毒體外感染復制模型的方法。

本發明提供的丙型肝炎病毒體外復制模型的構建方法，是通過以下技術方案實現的：

1.選擇一種病毒接種方法，將1個及以上丙型肝炎病毒感染患者血清混合，以振搖法進行接觸、吸附，以離心法進行培養。

2.選擇一種培養基，該培養基含有促進丙型肝炎病毒復制的鐵離子。

3.選用感染細胞裂解上清液反復感染正常宿主細胞，經多次培養以獲得具有較高感染率、能引起細胞形態改變的丙型肝炎病毒毒株。

本發明所述的丙型肝炎病毒體外感染模型的構建方法，具體有如下步驟：

(1)篩選接種物；

(2)篩選敏感宿主細胞株；

(3)進行病毒接種與培養；

(4)優化病毒培養條件；

(5)細胞培養適應毒株的獲得；

其中所述步驟(1)是將一個或一個以上丙型肝炎病毒感染患者血清混合；所述步驟(2)中的敏感宿主細胞為哺乳類細胞，包括肝源細胞、淋巴源細胞、腎源細胞、精子細胞的一種；所述步驟(3)是以振搖法常溫進行接種，吸附后，離心法進行培養；所述步驟(4)是常規細胞培養基成分中含有10-300μM的鐵離子；所述步驟(5)是HCV感染細胞裂解上清液反復感染正常宿主細胞，并經多次培養以獲得體外細胞培養適應毒株。