[發明專利]檢測結核菌和抗結核藥物敏感性的方法及試劑盒

無效

• 申請號: 200710093873.1
• 申請日: 2007-06-22
• 公開（公告）號: CN101329342A
• 公開（公告）日: 2008-12-24
• 發明（設計）人: 王霽;劉超;王坦;王毅翔
• 申請（專利權）人: 王霽;劉超;王坦;王毅翔
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543;G01N33/535
• 代理公司: 上海三和萬國知識產權代理事務所
• 代理人: 章鳴玉

技術領域

本發明屬于生物免疫學技術領域，具體涉及結核菌檢測的生物免疫學技術。

背景技術

隨著50年代初有效化療藥物的臨床應用，結核病(Tuberculosis，TB)的發生率以每年5％的速度遞減，但據世界衛生組織(WTO)的資料，1986-1990年的5年間有41.5％的發展中國家和25％的發達國家結核病病情上升，至今全球近1/3人口感染結核，每年約二百萬人死于結核病。全球結核病總體呈上升趨勢，人口的增長以及艾滋病的傳播更加劇疫情發展。結核病仍然是威脅人類生命健康以及阻礙國家經濟和社會發展的重大問題，因此，結核菌的檢測也顯得非常重要。

一般結核菌檢測方法有如下數種。

傳統的結核病診斷方法是涂片顯微鏡檢查和細菌培養，這些方法從1882年RobertKoch鑒定結核菌一直沿用至今。涂片顯微鏡檢查較為簡單，但敏感性差，單獨應用會造成大量漏診；細菌培養方法周期長(一般需6-8周)，延誤診斷與及時治療。

BACTEC檢測：Middlebrook等于1977年首先報告Bactec法(自動快速檢測法)，其基本原理是間接測定分支桿菌的代謝產物。優點是分離培養、藥敏試驗、菌型鑒定三項快速總報告時間為18.5天，而常規檢查法需時84.2天。缺點是污染率為5.6～9.3％，較常規法高，最主要的是設備昂貴，試劑全靠進口(張天民.結核病的診斷與治療進展.臨床內科雜志，1995；12(5)：10～2)。

色譜法：有氣相色譜(GC)、氣液相色譜、高效液相色譜(HPLC)等，GC等能檢測分枝桿菌代謝過程中的揮發性物質如脂肪酸所產生的CO₂含量，出現不同的色譜峰，從而可鑒定結核桿菌和大部分NTM菌種。簡單、快速、定量、重復性好，GC與質譜(MS)聯用更好；缺點是儀器昂貴，維護不易，無法普及。

聚合酶鏈反應(Polymerase?Chair?Reaction，PCR)：與傳統檢查方法相比較，有快速、敏感性高(能檢出1～20個細菌的DNA)、特異性強、標本無需培養以及簡便等優點。對肺結核病人痰、胸水、DALF(纖維支氣管鏡支氣管肺泡灌洗液)采用涂片、培養所得的檢測結果與PCR對比，陽性率明顯低于PCR。采用穿刺細胞學結合PCR技術有助于肺外結核病的早期診斷和鑒別診斷(趙玉榮，徐英杰.結核病診斷治療的進展.中級醫刊，1996；31(3)：15～7；李俊，吳強，魏艷華.PCR技術在肺外結核病細胞學診斷中的應用.臨床與實驗病理學雜志，1995；11(3)：209～10)。PCR是一種很有潛力且可以推廣的技術，在結核病診斷方面已獲得很有希望的成果。但PCR的缺點是污染帶來的假陽性，前處理不當所致的假陰性，且費用較高，目前尚缺乏嚴格統一規范化操作標準，作為一種臨床診斷方法，還需進一步探索。

核酸探針(DNA-probe)：DNA探針是一小段帶標記而能識別特異性核苷酸序列的單鏈分子。尚在研究中。

染色體核酸指紋法：有多種方法，如限制性內切酶圖譜(REA)和限制性酶切片段長度多態性(RFLP)分析等，RFLP用于菌株菌種鑒定和流行病學調查研究。1999年我國也有用IS?6110作DNA指紋法獲成功的報道，并發現同一患者的痰液和膝關節膿液培養陽性者的菌株指紋差異較大。顯示非同一感染來源。

16s-23srDNA(rRNA)序列法：用于分枝桿菌的菌種鑒定，差不多所有種的分枝桿菌都可鑒定出來，優于GC法。是最佳的用于研究的鑒定方法。

上述PCR反應、DNA-probe、染色體核酸指紋法和16s-23srDNA(rRNA)序列法全都處于研究階段，有的已相當成熟，但普遍用于臨床尚需經過一段時間的檢驗，以免重蹈PCR臨床應用的覆轍。

精制蛋白衍化物PPD試驗：用于鑒別診斷有參考意義。