[發明專利]動物關節軟骨組織總RNA提取方法

無效

• 申請號: 200710093163.9
• 申請日: 2007-12-18
• 公開（公告）號: CN101182343A
• 公開（公告）日: 2008-05-21
• 發明（設計）人: 初同偉;劉玉剛;周躍;歐娟娟
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第二附屬醫院
• 主分類號: C07H21/02
• 分類號: C07H21/02;C07H1/06
• 代理公司: 重慶志合專利事務所
• 代理人: 胡榮琿

技術領域

本發明涉及一種富含蛋白多糖的RNA提取方法，特別涉及一種動物關節軟骨組織總RNA提取方法。

背景技術

各種關節疾病和脊柱關節的疾病的治療一直是醫學界面臨的難題，國內外正在開始嘗試的基因治療有望獲得該領域治療的突破。從基因水平對軟骨組織進行研究意義重大，而從軟骨組織中提取高質量的RNA是各種基因表達研究的基礎。

關節軟骨基質多，細胞少，細胞成分只占20％，軟骨基質的主要成分是II型膠原，由于II型膠原中富含羥賴氨酸，并且羥賴氨酸的羥基幾乎全部和糖結合，因而糖化率高，含糖量約為10％，因此軟骨基質主要成分是蛋白多糖。關節軟骨屬于細胞含量少的組織，組織RNA含量低，并且多糖的理化性質與核糖核酸RNA非常相似，在沉淀RNA時，蛋白多糖和RNA一塊無區分的沉淀下來，產生富含多糖的凝膠狀沉淀，這種含有多糖的RNA沉淀難溶于水，或溶解后產生粘稠狀的溶液，這樣的RNA由于蛋白多糖的干擾無法進行后續的各種分子生物學試驗。在去除多糖的同時RNA也被帶走，造成RNA的大量丟失，因此從軟骨中提取高質、足量的RNA非常困難。

由于軟骨組織的特殊結構，目前尚無有效的方法來解決這一難題，基于酸酚/胍鹽原理的總RNA抽提方法是動物組織、細胞核酸分離的主要方法，如一步法、trizol法等，但基于酸酚/胍鹽原理的方法不適于富含多糖的動物組織，因為該種方法不能區分理化性質相似的多聚核糖和蛋白多糖，在進行RNA沉淀的時候，蛋白多糖和RNA一起沉淀下來，而去除蛋白多糖的步驟也是RNA損失的步驟。plant?RNAout法是基于CTAB裂解法的總RNA提取方法，其優點是操作簡便、易行，含CTAB的裂解液是用于富含多糖和多酚的植物總RNA抽提的首選細胞裂解方法，可以有效的分離植物組織中的多糖和RNA，但通過多次實驗證明，該方法用于抽提新西蘭白兔關節軟骨組織的總RNA時引入DAN污染。因此，我們試驗證明用一步法、trizol法、anima?RNAout法、植物RNA提取法等成熟的RNA提取方法都不能獲得高質量總RNA，采用經典的去除多糖的方法如高鹽、低醇沉淀法都不能去除大量的多糖。

發明內容

本發明的目的是提供一種動物關節軟骨組織總RNA提取方法，它適用于含蛋白多糖的RNA難提組織的小量總RNA提取，采用本發明方法提取的動物關節軟骨組織總RNA的收率高，并且質量好、純度高、完整性好，可以滿足分子生物學研究應用。

本發明方法有以下步驟：

(1)取動物關節軟骨組織，立即投入液氮中研磨至粉末狀，每50重量份的關節軟骨組織加入1體積變性液，0.007體積的β-巰基乙醇，勻漿至無明顯組織塊；

(2)將勻漿液置于冰水浴上，加酸性水飽和酚，搖勻，加醋酸鈉，氯仿、異戊醇混合液，置于冰水浴上15min；

(3)4℃下，離心，取上清液，加入氯仿、異戊醇混合液，離心取上清加入異丙醇，-20℃下沉淀30min，離心30分鐘，得到凝膠狀RNA和蛋白多糖混合沉淀，加入無RNA酶水，溶解沉淀得到膠狀溶液；

(4)取膠狀溶液用plant?RNAout試劑盒的RNA提取步驟得到總RNA沉淀，取沉淀，乙醇洗滌二次后用無RNA酶水溶解沉淀即得關節軟骨組織總RNA溶液。

本發明所述的重量與體積的計量單位，采用克與毫升或千克與升或微克與微升等。

通常細胞中約75％的RNA酶存在于胞液中，當細胞裂解后，RNA酶會釋放出來，在沒有有效的抑制措施下，RNA酶會迅速降解RNA。一步法所用的裂解液主要成分為異硫氰酸胍，它是一種強烈的蛋白質變性劑，能有效的抑制RNase活性，使RNase變性，裂解液中加入的β-巰基乙醇也是RNase的強烈抑制劑，聯合應用可有效防止RNA降解。