[發明專利]用發根農桿菌遺傳轉化粘毛黃芩獲得產黃芩苷的毛狀根的方法

無效

• 申請號: 200710093051.3
• 申請日: 2007-11-27
• 公開（公告）號: CN101182542A
• 公開（公告）日: 2008-05-21
• 發明（設計）人: 孫敏;雷桅;王淑芳
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/87;C12N5/10;C12Q1/68
• 代理公司: 重慶華科專利事務所
• 代理人: 康海燕

技術領域

本發明屬于分子生物學、生理學、育種學以及基因工程等領域，涉及一種利用轉基因技術獲得產黃芩苷的粘毛黃芩毛狀根的方法，具體涉及發根農桿菌遺傳轉化粘毛黃芩并獲得產黃芩苷的粘毛黃芩毛狀根的具體程序。本發明還提供利用基因工程技術獲得的產黃芩苷的粘毛黃芩毛狀根及其培養的子代。

背景技術

植物次生代謝產物具有極其復雜的化學結構，至今仍沒有找到有效的或經濟的合成方法。相對于常規細胞培養，毛狀根培養系統具有生長快速、不需外源植物激素、合成次生代謝物質能力強而且穩定、向培養液釋放部分代謝產物等優點。由于Ri質粒轉化的毛狀根生長快，易于培養，有效成分高，具有表達完整的代謝通路，為藥用植物次生代謝產物的工業化生產提供了廣闊前景。

目前，雖然國內外采用發根農桿菌遺傳轉化藥用植物獲得生產次生代謝產物的毛狀根的相關研究較多，但對遺傳轉化粘毛黃芩獲得產黃芩苷毛狀根的研究仍是空白。粘毛黃芩屬于唇形科黃芩屬多年生藥用草本植物。該屬植物約300多種，世界廣布，我國有100種以上，可作為黃芩藥用者約有7種左右，粘毛黃芩就是其中的一種。該植物主要藥用成分為黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素等黃酮類化合物，現代藥理學證實其具有清熱解毒、止血安胎、抗菌消炎、保肝利膽、降壓脫敏、防曬美白等作用。隨著國際上對黃芩苷等研究的持續升溫和認識的逐步深入，認為黃芩苷在清除氧自由基、減輕組織的缺血再灌注損傷、調節免疫、促進細胞凋亡以及抗腫瘤和HIV等多方面均有作用，具有重要的藥用價值和開發利用前景。然而目前獲得粘毛黃芩的主要技術是人工栽培，但存在生產周期長、成活率低、農藥殘留超標和有效成分較低等弊端，使得該方式商業前景尚不明朗。

發明內容

本發明的第一目的就是提供一種轉基因技術遺傳轉化粘毛黃芩獲得產黃芩苷毛狀根的方法，該方法將發根農桿菌Ri質粒的T-DNA導入粘毛黃芩中，獲得粘毛黃芩毛狀根；

本發明的另一方面，還提供了一種用上述方法轉化的宿主細胞，這種經轉化的宿主細胞發育為毛狀根。在實例中該宿主細胞是粘毛黃芩

本發明的技術方案如下：

一種獲得產黃芩苷粘毛黃芩毛狀根的方法和利用該方法獲得的產黃芩苷的粘毛黃芩毛狀根，該方法步驟如下：

(1)采用任何可能的手段獲得無菌的粘毛黃芩；

(2)采用任何轉基因方法轉移發根農桿菌的Ri質粒的T-DNA到粘毛黃芩細胞、組織、器官、植株中；包括以下步驟：

A、活化發根農桿菌；

B、發根農桿菌浸染粘毛黃芩外植體；

C、發根農桿菌與粘毛黃芩外植體的共培養，步驟如下：

I、將侵染后的粘毛黃芩外植體接種在MS+AS?100μmol·L^-1固體培養基上；

II、置于溫度為25℃±1.0℃恒溫暗培養1～5天

D、外植體的除菌培養；

(3)在特定的條件下篩選和鑒定毛狀根，方法如下：

I、提取粘毛黃芩毛狀根DNA

II、獲得含rolB和rolC引物的PCR反應體系；

III、PCR反應擴增毛狀根特有基因rolB和rolC；

IV、電泳檢測目標條帶；

(4)在適合的條件下培養粘毛黃芩毛狀根，用于生產黃芩苷。

用上述方法獲得的生命體，它是可生產黃芩苷的粘毛黃芩毛狀根。

在本發明中，術語“生命體”指粘毛黃芩的細胞、組織、器官、植株。

在本發明中，術語“任何轉基因方法”包括發根農桿菌Ri質粒介導遺傳轉化、基因槍法介導的遺傳轉化、花粉管通道介導基因轉化、生殖細胞浸泡法介導基因轉化。

在本發明中，術語“在特定的條件下篩選和鑒定轉化子”是指用在離體培養的條件下根據毛狀根特殊的形態學特征初步鑒定轉化子；可以使用PCR、Southern雜交、Northern雜交和Western印跡等方法來鑒定轉化子。

在本發明中，術語“在適合的條件下培養粘毛黃芩毛狀根”是指對經過鑒定的粘毛黃芩毛狀根離體培養，并檢測黃芩苷的含量，篩選黃芩苷含量提高的優良轉化子進行培養，獲得其后代。

在本發明中，利用轉基因技術，將發根農桿菌Ri質粒的T-DNA導入粘毛黃芩細胞獲得轉化毛狀根，通過篩選優良無性系，獲得黃芩苷及其相關黃酮類化合物含量相對較高而穩定的毛狀根無性系，為黃芩苷的生產提供一種新型優質的可持續使用的藥源。

具體實施方式