[發明專利]基于線粒體DNA T6680C單核苷酸多態性檢測高原肺水腫易感性的試劑盒

無效

• 申請號: 200710092817.6
• 申請日: 2007-10-01
• 公開（公告）號: CN101135665A
• 公開（公告）日: 2008-03-05
• 發明（設計）人: 高文祥;羅勇軍;高鈺琪;劉福玉;黃慶愿;陳建;周其全
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447;G01N21/64;G01N21/00;C12Q1/68
• 代理公司: 重慶華科專利事務所
• 代理人: 徐先祿

技術領域

本發明涉及一種疾病檢測用的試劑盒，具體涉及基于線粒體DNA?T6680C單核苷酸多態性檢測高原肺水腫易感性的試劑盒。

背景技術

高原肺水腫(high?altitude?pulmonary?edema，HAPE)是一種特發于高原低氧環境的肺水腫，是嚴重威脅進入高原人群健康和生命的急性重癥高原病。該病起病急，進展快，如果救治不及時，可在較短的時間內發展至呼吸衰竭，甚至死亡。文獻報道，在進入海拔3600多米的高原漢族人群中，高原肺水腫的發病率高達0.4％-2％。HAPE發病的有明顯的家族和個體易感傾向，這提示我們遺傳因素在HAPE發病機制中的發揮著重要的作用【張雪峰，高原施工人群急性重型高原病患病率調查，《高原醫學雜志》，2005；15(3)：7-8；陳有，高原肺水腫發病機制研究進展，《高原醫學雜志》，2005，15(2)：62-64；高鈺琪，高原肺水腫的發病機制及防治，《人民軍醫》，2005；482(2)：108-111】。

由于線粒體是低氧習服和適應中起著極其重要的作用，HAPB是一種習服不良的急性高原病，因而線粒體在HAPE的發生中發生著重要的作用【高文祥，低氧大鼠腦線粒體體外轉錄活性的研究，《中國應用生理學雜志》，2001；17：323-326；Moudgil?R，Hypoxic?pulmonary?vasoconstriction，《J?ApplPhys?iol》，2005；98：390-403】。單核苷酸多態性(SNP)，是一種新型的分子遺傳標記，廣泛應用于復雜疾病的易感性預測[Kato，Mitochondrial?DNApolymorphisms?in?bipolar?disorder，《J?Affect?Disord》，2001，62：151-164】。

LDR(連接酶檢測反應)是一種經濟、快速的檢測SNP常用的方法，其檢測原理是利用高溫連接酶實現對基因多態性位點的識別，高溫連接酶一旦檢測到DNA與互補的兩條寡聚核苷酸接頭對應處存在著基因點突變類型的堿基錯配，則連接反應就不能進行。測序分型原理如下：

(1)本技術方案先通過PCR(聚合酶鏈反應)獲得含有待檢測突變位點的基因片斷，然后進行LDR，最后通過測序儀電泳讀取檢測結果；

(2)檢測結果表明，左邊位點，即突變位點一為A/C雜合子，右邊位點，即突變位點二為T純合子(見圖1)。

LDR與傳統的SNP分型手段相比，LDR技術有多項優勢：

(1)準確度高：與PCR等技術的假陰性假陽性相比，LDR技術可以比較準確的對SNP進行分型；

(2)操作簡單：和目前的PCR技術相似，LDR反應操作簡單，對技術人員沒有特殊的專業要求；

(3)成本低：使用LDR檢測系統只需現有的PCR儀等分子實驗室儀器即可，無需再投入大量的資金購置設備；

(4)通用性強：成熟的LDR檢測系統適用于各種SNP位點的分型；

(5)高通量：LDR檢測系統可同時對多達上百個SNP位點進行分型，檢測效率高，滿足復雜疾病及藥物基因組學的診斷需求。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于線粒體DNA?T6680C單核苷酸多態性檢測高原肺水腫易感性的試劑盒，能用于高原肺水腫(簡稱HAPE)易感者的篩選，指導HAPE的預防。

發明人通過對206例漢族HAPE患者和144例漢族健康對照的線粒體DNA(mtDNA)的第6680位點SNP進行對比分析，研究mtDNA的SNP與HAPE的相關性，尋找出了敏感可信的HAPE易感生物遺傳標記。步驟是先通過對26例漢族無關個體的mtDNA的全長擴增，測序，初步提示mtDNA的6680位點為漢族人mtDNA的高頻位點。然后利用mtDNA的10398位點多態性，通過RFLP(限制性片斷長度多態性)將所有標本分為單倍群M和N。再通過(PCR聚合酶鏈反應)-LDR(連接酶檢測反應)反應在大樣本中(單倍群M和N)檢測mtDNA?T6680CSNP與HAPE的相關性。在單倍群M中，mtDNA的6680C在HAPE病例組頻率為12.2％，在漢族對照組中的頻率為1.7％(P＝0.028)。結論：單核苷酸多態性6680C是HAPE發病的危險因素，可以作為HAPE的遺傳標志之一。因此，基于該SNP位點，可以設計適當長度的引物與探針，用于PCR-LDR檢測高原肺水腫的易感性。