[發明專利]家蠶谷胱甘肽－S－轉移酶BmGSTe5基因

無效

• 申請號: 200710092538.X
• 申請日: 2007-08-07
• 公開（公告）號: CN101139610A
• 公開（公告）日: 2008-03-12
• 發明（設計）人: 魯成;余泉友;代方銀;潘敏慧;向仲懷
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/10
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司
• 代理人: 周韶紅

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種來自于家蠶的具有抗農藥或抗氧化活性的家蠶谷胱甘肽-S-轉移酶BmGSTe5基因。

背景技術

農藥在害蟲防治中起著非常重要的作用，但是隨著大量農藥的使用，昆蟲抗藥性日益加劇，迫使人們開發新的農藥產品或加大藥劑的用量，這不但制約了經濟的發展，也給環境帶來了嚴重的負擔，影響到了經濟和人類的可持續性發展。加之，昆蟲抗農藥與昆蟲的抗氧化往往聯系在一起，例如：昆蟲在解毒代謝有機磷農藥過程中，可能會產生一些活性氧等物質，從而誘導昆蟲的氧化應激反應，因此昆蟲在提高農藥抗性的同時，抗氧化的能力也在隨之增加。

谷胱甘肽-S-轉移酶(Glutathione?S-transferase，GSTs，EC?2.5.1.18)是一類重要的同工酶超家族，廣泛分布在動物、植物、酵母、細菌等生物體中，具有消除內源和外源性有毒物質的功能。在昆蟲體內它不但行使對多種有機合成農藥的代謝外，而且也具有消除昆蟲體內多余的自由基，保持體內的氧化與抗氧化的動態平衡。家蠶作為鱗翅目昆蟲的模式生物，對家蠶GST基因進行克隆，以及對其功能進行研究，為闡明GSTs與殺蟲劑抗性的關系，以及為農林害蟲的防治有著重要的理論和實踐意義。到目前為止，尚無有關家蠶的具有抗農藥或抗氧化活性的基因的研究報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種來自于家蠶的具有抗農藥或抗氧化活性的家蠶谷胱甘肽-S-轉移酶BmGSTe5基因，通過對該基因更進一步的研究，可為研制防治鱗翅目害蟲藥物提供理論基礎。

昆蟲中參與解毒代謝的GST主要是昆蟲特異的Delta和Epsilon家族成員，它們在昆蟲抗有機磷、有機氯和擬除蟲菊酯類農藥中起著非常重要的作用(Li等，2007)。本發明申請人利用NCBI中已知的其他物種GST的Epsilon家族成員，在家蠶基因組中檢索，獲得了Epsilon的同源基因。我們對其中一個Epsilon成員BmGSTe5基因進行了克隆。具體方法如下：

(1)首先以家蠶基因組中預測的編碼區序列(Coding?sequence，CDS)，在家蠶表達序列標簽(Expressed?sequence?tag，EST)數據庫中為BmGSTe5基因尋找EST證據，以CDS和EST序列設計特異性引物；BmGSTe5的正向引物：5’CATATGGTGTTCATCCTGTACAAAA?3’反向引物：5’GGATCCTGTAATATACTTAGTTGCCGA?3’；正反向引物中分別加有NdeI和BamHI酶切位點；

(2)以設計的特異性引物在家蠶5齡3的中腸cDNA為模板進行擴增，獲得了目的條帶，PCR產物回收后與pMD18-T載體連接，轉化DH5α感受態細胞，獲得陽性克隆后送往上海Sangon測序，測序結果表明擴增的序列與預期的結果一致；

(3)將含有目的片斷的T克隆與pET28a空質粒分別用NdeI和BamHI進行雙酶切，分別回收目的片斷，以T4連接酶將其連接并轉化B121(DE3)感受態細胞，篩選獲得含有pET28a-BmGSTe5的克隆，提取質粒并送往上海Sangon測序，獲得正確的克隆；將含有pET28a-BmGSTe5重組質粒的單克隆在含有卡那的LB培養基中37℃振蕩培養，至OD600＝0.6左右，加入IPTG使其終濃度為1mmol/L，繼續誘導培養5小時，取50ml菌液10000g離心5分鐘收集菌體沉淀，以His標簽純化目的蛋白質，純化方法按照pET寶典進行；目的蛋白對模式底物CDNB(1-氯-2，4-二硝基苯)的活性為12μmol/min/mgprotein。

(4)序列同源性分析：相似性比較在NCBI站點上用BLAST完成，BLAST分析表明，BmGSTe5與昆蟲特異的Epsilon家族成員相似性較高。

在NCBI中預測的保守結構域為：

BmGSTe5與模式底物CDNB的活性較高，說明在體內有較強的代謝農藥的能力，因此BmGSTe5為抗藥性相關的重要基因。

上述方法獲得的BmGSTe5基因完整的CDS及其推斷的氨基酸序列如下：

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