[發(fā)明專利]家蠶PIWI基因

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710092537.5
• 申請(qǐng)日: 2007-08-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101139595A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏慶友;王根洪;趙愛(ài)春;林英;向仲懷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C07K14/435
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 周韶紅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及Argonaute蛋白家族中一個(gè)與維持生殖細(xì)胞基因組遺傳穩(wěn)定性的PIWI基因。

背景技術(shù)

Argonaute蛋白家族是RNA調(diào)節(jié)的基因沉默的核心組成部分，其利用短的引導(dǎo)性RNA對(duì)特異目標(biāo)核酸的功能行使進(jìn)行調(diào)控。目前，與Ago類蛋白結(jié)合的小RNA中，研究得最為清楚的是miRNA和siRNA，二者在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。Ago類蛋白含有PAZ和PIWI兩類標(biāo)志性功能域。PAZ功能域是單鏈核酸的結(jié)合功能域，而PIWI功能域具有一個(gè)RNase?H的折疊。這些功能域明確顯示Ago類蛋白行使著RNA結(jié)合體的功能。進(jìn)化分析顯示Ago蛋白可以分為兩大亞家族：Ago亞家族和Piwi亞家族。在RNA干擾機(jī)制研究中，對(duì)于Ago亞家族的研究已經(jīng)取得了一些明顯的進(jìn)展。然而，對(duì)于Piwi亞家族的研究卻一直處于落后的狀態(tài)。

最近，Piwi類蛋白被發(fā)現(xiàn)與一類與miRNA和siRNA均不同的小RNA能夠結(jié)合，這些小RNA在是重復(fù)相關(guān)的小RNA，而且在精巢及早期發(fā)育胚子中明顯富積，研究表明這類小RNA來(lái)源于反轉(zhuǎn)座子及其他重復(fù)元件，與Piwi類蛋白一起，參與生殖細(xì)胞及干細(xì)胞中重復(fù)元件的沉默，維持其基因組的穩(wěn)定性。這一研究發(fā)現(xiàn)使得Piwi蛋白的研究迅速成為人們廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)。

家蠶是鱗翅目昆蟲(chóng)的代表，隨著全基因組序列的獲得，在各方面的研究都獲得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。但對(duì)于家蠶干擾機(jī)制的研究以及基因組穩(wěn)定性研究目前還幾乎是空白。家蠶是否存在保守的干擾機(jī)制，其生殖細(xì)胞基因組的維持以怎樣一種方式維持，目前尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明以家蠶全基因組序列為基礎(chǔ)，目的在于提供一種家蠶Piwi基因，并進(jìn)一步探索其在家蠶生殖細(xì)胞某些特定功能方面所起的作用，進(jìn)而為理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐服務(wù)。

根據(jù)已公布的其他物種Piwi類蛋白序列信息，對(duì)家蠶全基因組序列進(jìn)行同源搜索，結(jié)合EST序列信息，成功找到了家蠶中的Piwi蛋白類似物一個(gè)，對(duì)其進(jìn)行了克隆，并進(jìn)行了表達(dá)特征分析，序列的高度保守性及基因表達(dá)特征強(qiáng)烈暗示此基因?yàn)榧倚Q的Piwi基因，參與生殖腺某些特定功能的行使之中。具體方法如下：

(1)目標(biāo)序列獲得及數(shù)據(jù)庫(kù)建立

果蠅、人、老鼠等物種的核酸，蛋白序列及所有家蠶EST序列下載自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，形成總EST庫(kù)，基因組序列為本發(fā)明申請(qǐng)人與中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所采用鳥(niǎo)槍法共同測(cè)定；

(2)基因電子克隆

同源性比對(duì)采用從NCBI下載的BLAST(basic?local?alignment?search?tool)工具，采用DNASTAR中的Seqman進(jìn)行電子延伸，多序列比對(duì)采用Clustalw(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html)，預(yù)測(cè)基因的外顯子、內(nèi)含子結(jié)構(gòu)采用Sim4程序(http://gamay.univ-perp.fr/analyse_seq.sim4).得到可能的家蠶Piwi基因；

(3)家蠶Piwi類似物全長(zhǎng)cDNA基因的獲得

根據(jù)3’-RACE擴(kuò)增的編碼序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增片段克隆到Pmd18-T(TAKARA)載體上，然后進(jìn)行序列測(cè)定與拼接，從而獲得Leonurin的全長(zhǎng)cDNA基因；

(4)序列同源性分析

對(duì)翻譯出的蛋白序列與其他物種的Piwi蛋白進(jìn)行相似性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)家蠶Piwi類似物在家蠶中具有高度保守性。

(5)家蠶Piwi類似物表達(dá)特征分析

根據(jù)家蠶全基因組組織芯片數(shù)據(jù)，對(duì)家蠶Piwi類似物表達(dá)特征進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)Piwi在家蠶的生殖腺中高量富積，顯示家蠶Piwi類似物在家蠶生殖細(xì)胞某些特定功能方面起著重要作用。

獲得的家蠶Piwi類似物全長(zhǎng)cDNA基因及其推斷的氨基酸序列如下：

1????ATG?TCA?GAA?CCG?AGA?GGT?AGA?GGA?CGA?GCT?CGA?GGA?CGC?GCT?GGT??45

1?????M???S???E???P???R???G???R???G???R???A???R???G???R???A???G???15

46???CGT?GGT?GGT?GAT?GGA?GGC?GGA?CCA?GCA?CCA?CGA?CGT?CCA?GGG?GAA??90