[發明專利]異戊酰螺旋霉素I基因工程菌株的構建

無效

• 申請號: 200710090507.0
• 申請日: 2007-04-09
• 公開（公告）號: CN101054553A
• 公開（公告）日: 2007-10-17
• 發明（設計）人: 武臨專;王以光;馬春燕;赫衛清;周紅霞
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫藥生物技術研究所
• 主分類號: C12N1/00
• 分類號: C12N1/00;C12N15/54;C12N15/09;C12P19/62
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所
• 代理人: 楊厚;王為

技術領域：

本發明涉及基因工程技術在改造抗生素組分中的應用。

背景技術：

異戊酰螺旋霉素I是本研究室利用基因工程技術構建的必特螺旋霉素(原名為生技霉素)產生菌所產生的一個組分[“生技霉素的制造方法”，專利號：ZL97104440.6]、[“必特螺旋霉素高產菌株的獲得”，專利號：ZL?02148771.5]。必特螺旋霉素目前即將完成第III期臨床實驗。實驗結果表明，在治療呼吸道感染等疾病方面，顯示了較好的臨床療效和安全性。

除異戊酰螺旋霉素I組分外，必特螺旋霉素成品中還包含異戊酰II和III組分，同時還含有少量4”丁酰基、丙酰基、乙酰基的衍生物及少量的螺旋霉素I、II、III(總含量應不超過5％)。目前現行的必特螺旋霉素成品質量標準中，規定其含有9個組分，4”酰化螺旋霉素總含量為80％，其中異戊酰螺旋霉素(I、II、III)3個組分的總含量為65％。而在必特螺旋霉素發酵液中還存在較大比例的螺旋霉素I、II、III，尤其II和III組分相對較多。必特螺旋霉素發酵液中的螺旋霉素主要依賴化學提取工藝將其清除。因此，抗生素發酵產品的多組分問題，給藥品質量標準的制定以及發酵工藝和提取過程監控，經常帶來很大的困難和挑戰。所以，在不影響生物學活性的前提下，獲得單一組分生產菌種，已成為抗生素研究和生產面臨的重要課題。

必特螺旋霉素是以螺旋霉素為母核，利用基因工程技術在其4”位-羥基進行異戊酰基化所產生的。而螺旋霉素產生菌通常產生SPI、II、III三個組分，即內酯環3位分別為羥基(SP?I)、乙酰基(SP?II)和丙酰基(SP?III)，結構式如圖A所示。SP?I、SP?II、SP?III三個組分的生物學活性基本一致。螺旋霉素產生菌產生SPI、II、III三個組分的生化機理，是由3-O-酰基轉移酶催化內酯環3-O-羥基所致。本研究室曾在獲得螺旋霉素3-O-酰基轉移酶基因序列(專利申請號200610087230.1，SEQ?ID?No.1)基礎上，通過基因阻斷技術，獲得了主要產生螺旋霉素組分I的菌種。但是，僅僅產生異戊酰螺旋霉素I為主組分的菌種，迄今尚未見到相關報道。

??????????????????????????螺旋霉素結構

本發明的目的在于，借鑒上述成果，在必特螺旋霉素產生菌中通過破壞編碼3-O-酰基轉移酶基因，以獲得產生異戊酰螺旋霉素I為主組分的基因工程菌。

發明內容：

根據已經獲得的3-O-酰基轉移酶基因及其兩翼序列，在3-O-酰基轉移酶基因序列中可以破壞該基因的任意區段設計1個引物，并插入4個任意設計的酶切位點，經PCR獲得兩個1.0kb左右的同源臂，酶切后將兩個同源臂互連，另外兩側與能轉入必特螺旋霉素產生菌的載體相連接，以必特螺旋霉素產生菌(ZL02148771.5，菌種保藏號：CGMCC?No.0304)總DNA為模板，經PCR分別擴增兩個與3-O-酰基轉移酶基因同源片段，并以相應酶切位點插入具有選擇性標記的鏈霉菌/大腸桿菌穿羧質粒載體，也可在兩個同源基因中插入和使用質粒不同的選擇性標記片段，構建重組質粒。將所構建的重組質粒轉入必特螺旋霉素基因工程菌，以質粒上攜帶的選擇性標記篩選轉化子，根據轉化子展現的選擇性標記差異和PCR驗證，獲取因同源基因雙交換而使3-O-酰基轉移酶基因破壞的基因工程菌，稱之為BT3-O-ATΔ變株。該基因工程菌在一定條件下，經發酵培養和產物的初步化學提取以及HPLC檢測其發酵產物，證明本發明提供了產生異戊酰螺旋霉素I為主組分的基因工程菌。

發明效果：

本發明利用基因工程技術將原必特螺旋霉素基因工程菌中的3-O酰基轉移酶基因實施破壞，獲得了只產生異戊酰螺旋霉素組分I的菌種。該菌種的獲得，，使得必特螺旋霉素類抗生素發酵液中的多組分狀況獲得明顯單一化，這將有助于簡化生產過程發酵工藝的調控，實現提取過程的優化，提高收率，降低能耗和生產成本，為推進必特螺旋霉素類抗生素的產業化創造良好條件。

附圖說明：

圖1.用于3-O-酰基轉移酶基因破壞的重組質粒pKCL1-4的構建及同源雙交換

其中：Apramycin(阿普霉素抗性標記)；

??????GTG和TGA表示3-O-酰基轉移酶基因閱讀框的起始和終止密碼子；

??????a，b，c，d為PCR反應所設計的引物。

圖2.染色體基因組PCR產物電泳(確證3-O-酰基轉移酶基因的破壞)

其中：1.基因工程菌BT3-O-ATΔ變株；

??????2.必特螺旋霉素產生菌原株；