[發明專利]斑節對蝦熱休克蛋白90基因序列

無效

• 申請號: 200710089975.6
• 申請日: 2007-03-26
• 公開（公告）號: CN101092623A
• 公開（公告）日: 2007-12-26
• 發明（設計）人: 江世貴;邱麗華;周發林;張漢華
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院南海水產研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/435
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司
• 代理人: 宣國華

技術領域

本發明涉及分子生物學中基因克隆領域，尤其涉及斑節對蝦熱休克蛋白90的基因的核苷酸及氨基酸序列。

背景技術

熱休克蛋白90(Hsp90)是一類特異的分子伴侶，在進化中具有高度保守性。早期認為它可協助變性蛋白從高溫或其它應激環境中復性，并可促進已產生突變的蛋白質降解。近年來的研究顯示Hsp90具有廣泛的生理功能，它參與調節多種蛋白質在非應激條件下的生物活性，其中包括調節DNA的復制、基因轉錄、亞細胞結構的蛋白質轉移、細胞信號轉導、免疫應答、以及生長、發育、凋亡等。Hsp90還與Ras信號途徑中許多信號分子的折疊與組裝密切相關，主要是Hsp90的結合與解離，介導了這些分子在非活性形式與活性形式間的轉化或在一定條件下，從Hsp90等與之形成的復合物中釋放，才能轉位至胞膜，行使激酶的活性功能。Hsp90還具有使突變蛋白質具備類似野生型構象活性的作用。因此，研究這類進化上非常保守的蛋白的基因表達調控機制和相關的信號轉導是非常重要的。

發明內容

本發明的目的是提供一種斑節對蝦熱休克蛋白90基因序列，它通過以近源物種熱休克蛋白的基因的CDS序列的保守區設計的兼并引物，并用PCR法擴增，結合RACE技術克隆到斑節對蝦熱休克蛋白90基因的全表達序列。

上述目的是通過以下技術方案來實現的：

解剖斑節對蝦取出性腺，提取總RNA，使之與反轉錄引物(oligo-dT接頭引物)混合，進行反轉錄，合成第一鏈cDNA。

從GenBank中下載近源物種(如人、牛、斑馬魚、爪蛙等)熱休克蛋白90同源基因CDS序列，利用Clustal?W軟件進行多序列比對，確定保守區，根據保守區序列設計兼并引物，擴增片段大小約為680bp。引物設計后采用β-乙睛亞磷酰胺化學法進行DNA合成得到以下引物序列：

X90F：5’-ATgATTggACAgTTYggTgT-3’

X90R：5’-TACAgYTTgATITTgTTCTT-3’。

以合成的第一鏈cDNA作為模板，用兼并引物進行PCR擴增，所擴增的PCR產物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，從凝膠中純化回收目的產物。然后將純化的PCR產物克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌JM-109感受態細胞，挑取陽性克隆，提取質粒DNA。經簡并引物PCR檢測后，將具有插入片段的質粒DNA用M13通用引物進行雙向測序。

本發明另外再根據已得到的第一鏈cDNA片段序列設計特異性引物，利用cDNA末端快速擴增技術(Rapid?Amplification?of?cDNA?ends，RACE)對目的基因的3′和5′末端進行PCR擴增。

在3′端的快速擴增中，利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由基因引物和接頭引物進行PCR反應，擴增片段大小約為1500bp。所述的基因引物和接頭引物序列為：

基因引物：5’TCGGGGACTTCGCATACATC?3’

接頭引物：5’GGCCACGCGACTAGTAC?3’。

經3′端的快速擴增后的序列在其5′端進行快速擴增，利用末端轉移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C)尾后，以加尾后的cDNA作為模板，利用外側特異性引物和oligodG進行第一次PCR擴增，所得PCR產物再利用內側引物和oligodG進行第二次PCR擴增。所述引物序列為：

oligo-dG：5’GGGGGGGGGGGGGGGH?3’

基因外側引物：5’GGCCACGCGACTAGTAC?3’

基因內側引物：5’GCCGACAAGGTGACCGTAGT?3’。

經末端快速擴增技術進行PCR所得到的PCR產物在1.2％的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測后，將PCR產物純化后，克隆到pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌JM-109感受態細胞，挑取陽性克隆，用M13引物對質粒DNA進行測序，測序所得序列再與兼并引物擴增所得的序列利用Clustal?W軟件進行拼接得到目的基因。

斑節對蝦熱休克蛋白90基因的分離，對于研究軟體動物體內的熱休克蛋白90對環境中的污染因素的應激反應，從而探討能否將該分子作為一種生物學指標具有重要的理論意義和實踐意義。而且該基因對性腺發育具有促進的作用，因此可以通過對基因的克隆獲得純化的蛋白，來進一步檢測該基因是否影響斑節對蝦的性腺發育。

附圖說明

圖1是本發明在取溫度升高前后體內的不同組織器官中的表達；