[發明專利]利用農桿菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的轉化效率的方法

無效

• 申請號: 200710089956.3
• 申請日: 2007-03-23
• 公開（公告）號: CN101092633A
• 公開（公告）日: 2007-12-26
• 發明（設計）人: 祝建波;張煜星;崔百明;王愛英;劉紅玲;李小紅;王彥芹
• 申請（專利權）人: 石河子大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/31;A01H1/04;A01H1/02
• 代理公司: 石河子恒智專利代理事務所
• 代理人: 李伯勤

1、一種利用農桿菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的轉化效率的方法，其特征是通過以下過程實現的：

(1)植物增強型綠色熒光蛋白基因植物表達載體的構建；

(2)virD₁、virD₂和virE₂基因克隆、原核表達分析；

原核表達載體的構建及表達分析：將virD₁、virD₂和virE₂基因從克隆載體上切下，將其融合到分泌型原核表達載體，大腸桿菌周質蛋白phoA或外膜ompA蛋白信號引導肽核酸序列的下游，構建成分泌型原核表達載體，轉化到L型細胞壁缺陷的大腸桿菌中，產物直接分泌到培養基中，進行提取純化，用純化的蛋白加弗氏佐劑免疫新西蘭白兔，抽提血清，制備一抗并測定效價，

(3)virD₁、virD₂和virE₂基因植物瞬時表達載體的構建；

植物瞬時表達載體的構建：利用農桿菌Ti質粒的序列圖譜和酶切圖譜，在virD₁、virD₂和virE₂基因編碼區兩側設計特異性引物，并在引物上加上用于克隆的酶切位點，通過高保真PCR技術進行相應的基因擴增，將產物直接構建到帶有抗卡那霉素標記基因的植物表達載體上，將帶有強植物啟動子-毒蛋白基因-終止子的完整的表達框切下，構建到高效克隆載體pUC18的多克隆位點上，獲得不帶左右邊界序列的植物瞬時表達載體；

(4)virD1、virD2和virE2基因或蛋白與報告基因經脂質體包裝，對煙草原生質體轉化的瞬時表達和轉化整合頻率研究；

T-DNA蛋白復合物的體外組裝：將需要轉化的帶有目的基因pBin-EGFP植物表達載體，加入到植物細胞提取液中，并按順序加入提取并純化的virD₁、virD₂蛋白，接著加入DNA聚合酶I，通過缺口平移產生相應的T-DNA單鏈，加入virE2蛋白孵育，然后用核酸酶完全消化混合物，凝膠阻滯電泳分析，與此同時酚氯仿抽提蛋白，乙醇沉淀、純化DNA，最終通過特異性引物，對相應T-DNA片段進行熒光定量擴增，評估virD₁、virD₂和virE₂蛋白活性，研究T-DNA蛋白復合體最佳組裝方式和濃度配比；

脂質體包裝：將T-DNA蛋白復合物或virD₁、virD₂和virE₂基因與含有目的基因GFP質粒載體按一定比例混合，用陽離子脂質體進行包裝處理，并對煙草原生質體進行轉化，用熒光顯微鏡對轉化細胞進行瞬時表達研究，同時利用抗生素，對轉化煙草體細胞系進行多代篩選，再生植株并檢測其整合效率，以此間接推斷毒蛋白在植物體內的組裝活性，在此基礎上對脂質體最佳轉化條件及緩沖液組成進行研究；

(5)在virD1、virD2和virE2基因能在植物體內正常表達并具有活性的基礎上，利用農桿菌轉化植物的機理，將脂質體轉化和花粉管通道技術相結合，對棉花轉化效率及遺傳穩定性進行研究和評價；

(6)改良花粉管通道技術體系的評價：在(4)(5)研究的基礎上，利用農桿菌轉化植物的機理，將脂質體轉化和花粉管通道技術相結合，田間對特定的棉花進行轉化，后代在苗期利用抗生素及長波紫外燈進行篩選，同時進行分子驗證，確定其轉化頻率同時對轉基因后代進行連續多代系譜式的跟蹤調查，研究其遺傳穩定性。

2、如權利要求1所述的利用農桿菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的轉化效率的方法，其特征在于所述的過程中，按每1×10⁵～5×10⁶個原生質體細胞分別加濃度為5～25μLpUC-pBin-GFP的質粒、濃度為5～15μL?pUC-pBin-VirD₁、5～15μL?pUC-pBin-VirD₂和5～15μLpUC-pBin-VirE₂的協助基因進行組裝。