[發明專利]表達豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的重組乳酸乳球菌及制法

無效

• 申請號: 200710089251.1
• 申請日: 2007-03-16
• 公開（公告）號: CN101058798A
• 公開（公告）日: 2007-10-24
• 發明（設計）人: 唐麗杰;李一經;葛俊偉;歐笛
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/33;C12N15/09;C07H21/04;C12N15/74;G01N33/53
• 代理公司: 哈爾濱市哈科專利事務所有限責任公司
• 代理人: 祖玉清

1、一種表達豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的重組乳酸乳球菌，其特征是：它是保藏在中國典型培養物保藏中心的保藏編號為CCTCC?NO：M?207020的重組乳酸乳球菌。

2、一種如權利要求1所述的表達豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的重組乳酸乳球菌的制法，其特征是：

(1)TGEV?S基因乳酸乳球菌表達載體的構建

以質粒pUC-S為模板，以TS7和TS8為引物擴增含有TGEV?S基因A、B、C、D?4個主要抗原位點的2007bp目的片段，命名為Sa，Sa基因與pNZ8112載體質粒進行酶切、連接并經電轉化轉入感受態細胞NZ9000，獲得含有重組質粒的乳酸乳球菌命名為Lactococcus?lactis?NZ9000/pNZ8112-Sa/NZ9000；所述的引物序列為：

(2)TGEV?S蛋白在乳酸乳球菌中的誘導表達

pNZ8112-Sa/NZ9000陽性重組菌及pNZ8112/NZ9000空質粒對照菌，接種于GM17液體培養基中，30℃厭氧培養過夜后，取過夜培養物以體積比1∶25比例接種于20ml培養基中進行擴增培養，30℃培養至OD₆₀₀為0.4；取10ml細菌培養液用質量濃度1ng/ml的乳鏈桿菌肽Nisin誘導2-3h；終止培養后分別取出1ml樣品經溶菌酶處理后進行SDS-PAGE及Western-blot分析；

(3)間接免疫熒光檢測

取12小時培養的陽性重組菌和空載體對照菌液體培養物0.5mL離心去上清后，分別用磷酸鹽緩沖液PBS低速離心洗三次，加入兔源抗TGEV抗血清，懸浮混合后37℃作用30分鐘，離心去上清，PBS離心洗菌體三次，加入稀釋的含有伊文思藍的抗兔異硫氰酸熒光素熒光標記二抗，懸浮混合后37℃作用30分鐘，離心去上清，PBS離心洗菌體三次，菌體沉淀物懸浮在200μl?PBS，取適量涂片，自然干燥后，冷丙酮固定30min，干燥后熒光顯微鏡觀察。