[發明專利]一種新型煙葉發酵酶制劑生產方法

無效

• 申請號: 200710085338.1
• 申請日: 2007-03-01
• 公開（公告）號: CN101254027A
• 公開（公告）日: 2008-09-03
• 發明（設計）人: 韓偉;陳應昆;何寶玉
• 申請（專利權）人: 韓偉;陳應昆;何寶玉
• 主分類號: A24B15/20
• 分類號: A24B15/20;C12N9/02;C12N9/50;C12N9/98
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技術領域

煙葉自然發酵。

背景技術

在煙葉調制過程中，對經初烤和復烤后的煙葉在合適的溫度和濕度條件下進行充分的發酵是提高和改善煙葉品質極為重要的技術環節。因此，對發酵機理的研究多年來一直是國內外相關學者和卷煙生產商們關注的焦點。其中一個重要研究領域就是煙葉發酵的酶機理的闡釋和應用。早在1950年(Frankenburg，W.G.)就有學者提出了煙葉發酵由酶催化的理論框架。隨著研究的深入和積累，現在普遍認為煙葉本身所含的氧化還原酶類主導發酵作用，而且這種發酵過程是多種酶聯合作用的結果，從而促使底物向多種香氣物質成分的有效轉化。這些酶促反應過程主要包括以下幾個方面：1、萜烯類化合物降解過程。類胡蘿卜素是煙葉中最重要的一類萜烯化合物，其是50多種煙葉特有香氣成分的前體；2、Mailard反應。該反應過程是還原糖和氨基酸經分子重排后生成56種雜環化合物-類黑素，類黑素的形成使煙葉表現陳煙香氣。盡管Mailard反應本身不是由酶催化的反應，但其底物-還原糖和氨基酸是酶促反應的產物。蛋白質在蛋白酶的作用下水解成氨基酸，淀粉和糖在水解酶的作用下水解生成葡萄糖、果糖等還原糖。因此，促進多糖和蛋白質的轉化將有利于Mailard反應的進行；3、葉綠素的降解反應。煙葉中殘存的葉綠素是卷煙制品在吸食過程中產生青雜氣的根源，應在調制過程中加以控制。盡管煙葉葉綠素絕大部分已經在煙葉烘烤過程中被降解，但殘存的葉綠素仍然會對卷煙制品帶來不良影響；4、游離煙堿降解，消除強烈刺激性和不良余味；5、酰胺與易分解氨氮化合物的脫氨揮發作用。煙葉氨氮化合物在發酵過程中脫去氨基生成有機酸和氨氣，有機酸積累與氨氣自然揮發可提高發酵效果。這五個方面是煙葉發酵過程中主要的酶促反應過程，其它還包括一些小分子物質的緩慢物理揮發過程及次要的煙葉內含物轉化反應。然而，煙葉在烘烤過程中的干燥脫水使煙葉內酶群絕大部分失活，因此不利于上述酶促反應的進行。基于這些認識，在煙葉發酵過程中添加專一性酶系或復合酶種促進煙葉發酵、加速煙葉內含物轉化已經成為增加煙葉香氣、加速發酵過程的一條途徑。

張立昌報道了一種適合在打葉復烤時添加的酶制劑，對自然醇化和人工發酵煙葉的質量有明顯的改善作用。該酶制劑可明顯增加卷煙香氣，減輕青雜氣和刺激性，改善卷煙吸味品質。趙銘欽等利用4種具有生物活性的α-淀粉酶、蛋白酶等配制而成的煙草發酵增質劑進行煙葉發酵，試驗表明煙葉香氣質改善、香氣量增加、煙葉固有雜氣和刺激性減輕，煙葉內部的糖、氮、堿等主要化學成分及其比值趨于協調、平衡。在這些研究過程中所用的酶主要為糖化酶、纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶。

阮祥穩等申請的中國專利CN200510042773.7公開了一種由多種外源生物酶(纖維素酶、蛋白酶、果膠酶、淀粉酶、糖化酶)及酵母粉組成的復合酶制劑，其特征在于多種生物酶及酵母粉按照特定的比例直接進行組配。專利CN03114578.7公開了由纖維素酶、蛋白酶、轉化酶、麥芽糖酶、溶菌酶組成的酶制劑。專利CN87101362.2公開了由纖維素酶、果膠酶、木質酶及蛋白酶的多種酶系的微生物復合酶。

以上文獻和專利的一個共同特征是直接采用外源(微)生物酶經特定比例混合后直接進行手工操作施用，對如何保護酶活性及如何滿足卷煙企業批量生產的要求沒有進行描述。

發明內容

本發明提出一種煙葉發酵酶制劑的制備及生產工藝。該酶制劑的復合酶群來自于新鮮煙葉，經組織勻漿、酶群純化、輔基置換分子修飾及蔗糖低聚物保護后得到由葡萄糖氧化酶、葉綠素氧化酶、類胡蘿卜素氧化酶、蛋白酶及煙堿降解酶五類酶組成的復合酶制劑。具體生產工藝如下(圖1)：

1、取鮮活煙葉或頂杈破碎細胞，測其體積，加緩沖液A(體積比V_汁液∶V_緩沖液＝1∶9)；

2、于4℃，2600g離心20min，取上清液并測體積，緩慢加入(NH₄)₂SO₄(144g/L)至含25％(NH₄)₂SO₄(W/V)；

3、4℃緩慢混合30min，4℃15000g離心40min；

4、取上清液并測體積，加入(NH4)₂SO₄(390g/L)至含80％(NH₄)₂SO₄(W/V)；

5、緩慢混合2h或過夜，4℃15000g離心2h，收集沉淀，加緩沖液A至沉淀充分溶解；