[發明專利]一種適合大規模中國倉鼠卵巢細胞培養的無血清培養基

無效

• 申請號: 200710085142.2
• 申請日: 2007-03-14
• 公開（公告）號: CN101117624A
• 公開（公告）日: 2008-02-06
• 發明（設計）人: 寇庚;王皓;錢衛珠
• 申請（專利權）人: 上海中信國健藥業有限公司
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及細胞培養領域。更具體地，本發明涉及用于CHO細胞培養的培養基。

背景技術

中國倉鼠卵巢細胞——CHO細胞(Chinese?hamster?ovary?cell)目前被廣泛用于生產各種基因工程蛋白產品。適合用于CHO細胞培養的培養基，根據它的來源及成分的明確程度來劃分，其發展大致可分為三個階段：即天然培養基階段(直接采用某些組織凝塊、生物性液體和組織提取液等作為細胞的培養基)，合成培養基階段(如MEM，DMEM，RPMI1640，F12等)和無血清培養基階段。合成培養基通常需在其中添加一些諸如血清(常用的如小牛血清、胎牛血清等，一般在5-15％)等天然的體液性補充物才能較長時間地維持細胞生長。血清的主要作用在于向細胞提供激素(生化因子)、轉移蛋白和其它營養物質等。但即使采用低血清培養，還是不能忽視血清帶來的問題(如在培養過程中貼壁，不適用于大規模培養)。無血清培養基的優勢很大程度上體現在避免了血清的缺點，此外它還具有血清培養難以比擬的優點，如保存和應用方便；使用該種培養基制備的產品易于純化，提高回收率；成分明確，有利于研究細胞的生理調節機制；可根據不同細胞株設計和優化出適合其高密度生長或高水平目的產物表達的培養基等。因此，近年來許多科研工作者致力于開發無血清培養基。

姚偉公開了一種“國產改良型DMEM培養基”用來培養CHO-C28細胞(《中國生物制品學雜志》2003，16(6)：380-383)，解決了CHO-C28細胞大規模培養過程中易增厚、脫落和不易維持的難題。

趙國勝公開了一種“純化人CD34⁺細胞的無動物血清培養”方法(《國外醫學輸血及血液學分冊》1998，21(4)：263-264)，介紹了無動物血清基質液(ASF)培養人骨髓和外周血分離的CD₃₄⁺細胞，在這ASF系統中，應用不同的生長因子的組合，培養CD₃₄⁺細胞。與含有10％胎牛血清培養基進行比較，ASF培養細胞和祖細胞，同樣生長良好。

CN00816020(發明名稱為：用于無蛋白無血清培養細胞的培養基)描述了一種培養基，所述培養基用于無蛋白無血清培養細胞，尤其是哺乳動物細胞，該培養基含有一定比例的大豆水解產物。

WO200123527公開了一種包含大豆水解物的無血清、無蛋白培養基。該培養基組成為不超過10％干重的大豆水解物，內毒素的含量不超過500U/g。培養基內還含有氨基酸(半胱氨酸、脯氨酸、色氨酸)或氨基酸混合物。培養基內還含有其它輔助成分、緩沖因子、抗氧化物及蛋白酶抑制劑等。

綜上所述，各國科學工作者雖然開發了許多無血清培養基，各培養基大都只適用于一種或一類細胞生長，尤其是缺少適用于大規模CHO細胞培養、且培養效果與有血清培養基相當或更佳的培養基，而對于市售可得的可用于大規模CHO細胞培養的無血清培養基如培養基Excell325^PF在使用過程中也存在著細胞密度和蛋白表達量低等問題。因此，本領域迫切需要開發新的適合CHO細胞大規模培養的無血清、無動物組分的培養基。

發明內容

本發明需要解決的技術問題是提供一種適合大規模培養CHO細胞的無血清的培養基，以彌補現有技術的不足。

本發明需要解決的另一個技術問題是提供該培養基的用途。

在許多基礎培養基中，已經含有了許多微量元素、糖類等營養物質。例如，DMEM/F12(可從Sigma，GIBCO公司等處購買獲得)。就是細胞培養中常用的商品化的基礎培養基，該培養基由葡萄糖、氨基酸、維生素、無機鹽等多種物質組成，為了使細胞在無血清培養基中生長，必須添加結合蛋白、激素、生長因子、低分子量營養物質如微量元素、脂類等，同時應當使培養基中蛋白含量盡量減少，以降低成本，有利于分離純化，適于工業化生產的特點，從而使得培養效果相當于或優于有血清培養基。

為了適合CHO細胞的生長，適宜在DMEM/F?12的基礎上添加如下物質：

(1)轉鐵蛋白：結合鐵的糖蛋白，與細胞表面專一受體作用，傳遞鐵離子，協助鐵的吸收，可絡合有害離子，起解毒作用，同時還有生長因子的作用。

(2)低分子量營養物質

微量元素主要起調節、傳遞和控制的作用，在無血清培養基中的作用尤為重要，如：

Fe：酶和血紅素的輔基，是線粒體中呼吸鏈的組成部分。

Cu：超氧化物歧化酶的輔基，是線粒體中呼吸鏈的組成部分。

Mg：對ATP酶、激酶等起活化作用。

Zn：酶的輔基。