[發(fā)明專利]一種生物分子高通量定量檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710078469.7
• 申請(qǐng)日: 2007-05-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101101292A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-01-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔣天倫;府偉靈;陳鳴
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
• 主分類號(hào): G01N33/53
• 分類號(hào): G01N33/53;G01N21/64;G06F19/00
• 代理公司: 北京同恒源知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 劉憲池

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生物分子高通量定量檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

在生物學(xué)研究和臨床診斷中，經(jīng)常需要了解研究標(biāo)本或臨床標(biāo)本中含有多少種生物分子及其含量的信息。在高通量定量檢測(cè)方法(high?throughputdetection?methods)問(wèn)世以前，需要了解一個(gè)標(biāo)本中存在多少種生物分子，就需要對(duì)該標(biāo)本實(shí)施多少次檢測(cè)，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且在實(shí)際工作中，研究標(biāo)本和臨床標(biāo)本的數(shù)量往往是有限的，難以對(duì)其實(shí)施太多次數(shù)的檢測(cè)，極難獲得大量的檢測(cè)信息。因此，高通量定量檢測(cè)技術(shù)不僅可以大幅度提高生物學(xué)研究和實(shí)驗(yàn)診斷的檢測(cè)效率，還可以大幅度提高從一個(gè)有限量標(biāo)本中可以獲得的信息豐度。

需要從標(biāo)本中檢測(cè)的生物分子稱為檢測(cè)目的分子或檢測(cè)靶分子(targetmolecules，TMs)。現(xiàn)有生物學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)每種TM都存在至少一種能與之發(fā)生特異性結(jié)合的生物分子，稱為這種TM的生物分子識(shí)別元件(biomolecularrecognization?elements，BREs)。與BRE的特異性結(jié)合常被用作TM分離和檢測(cè)方法的技術(shù)基礎(chǔ)。

生物芯片(Biochips)技術(shù)作為第一個(gè)高通量生物分子檢測(cè)技術(shù)，很好地詮釋了高通量定量檢測(cè)方法對(duì)生物學(xué)研究的巨大促進(jìn)作用。生物芯片采用微型電子與微機(jī)械系統(tǒng)(Micro?Electronic?Mechanical?System，MEMS)，將不同TMs的BREs分別固定在某個(gè)固相支持物上，并排列成有序的點(diǎn)陣，稱為生物芯片。其中，固相支持物稱為生物芯片的片基(film?base)，每個(gè)BRE在基片上的占位稱為芯片的1個(gè)位點(diǎn)，所有位點(diǎn)組成的點(diǎn)陣稱為生物芯片的探針微陣列。生物芯片與待測(cè)標(biāo)本反應(yīng)之后，不同的TM被位于某一位點(diǎn)的特異性BRE所結(jié)合，再用一種報(bào)告分子，如熒光分子，來(lái)指示這種TM與BRE的特異性結(jié)合，使得結(jié)合了TM的位點(diǎn)發(fā)生可以被機(jī)電技術(shù)或人工識(shí)別的變化。反過(guò)來(lái)，通過(guò)判讀生物芯片與待測(cè)標(biāo)本反應(yīng)之后不同位點(diǎn)的變化，根據(jù)預(yù)先確定的位點(diǎn)與BRE的對(duì)應(yīng)關(guān)系，一次檢測(cè)反應(yīng)就可以檢出待測(cè)標(biāo)本中成千上萬(wàn)的生物分子。生物芯片實(shí)現(xiàn)高通量定量檢測(cè)的技術(shù)引起了相關(guān)領(lǐng)域?qū)W者的極大興趣和高度重視，被不斷派生、發(fā)展和應(yīng)用，對(duì)比較基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物篩選和臨床檢測(cè)等學(xué)科的發(fā)展起到了積極的推動(dòng)作用，被譽(yù)為21世紀(jì)生命支撐平臺(tái)。

但是，生物芯片也存在由其方法學(xué)原理所決定的固有不足，主要是：(1)反應(yīng)效率不高，所有TMs的BREs都被固定在一個(gè)固相基片上，使得芯片與待測(cè)標(biāo)本的雜交成為一種固-液相模式的雜交，固液相雜交反應(yīng)存在空間位阻作用，降低了TM與BRE結(jié)合的效率，使得芯片雜交往往需要過(guò)夜；(2)重復(fù)性不佳，生物芯片不同片基對(duì)BRE的吸附能力不同，片基不同位點(diǎn)吸附BRE的效率不同，報(bào)告分子對(duì)不同標(biāo)本的標(biāo)記效率也存在差異，這使得生物芯片難以取得較好的重復(fù)性，有報(bào)道指出生物芯片的重復(fù)性一般在85％以內(nèi)；(3)不能用于定量分析，為了提高生物芯片的重復(fù)性，研究者在生物芯片中引入了內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)化信噪比(Internally?Normalized?Ratio，INR)，可以作為消除TMs-BREs結(jié)合效率差異的對(duì)照，也可以消除潛在的不同熒光分子的標(biāo)記效率差異，但由于抗體抗原結(jié)合的差異、標(biāo)記差異等原因，根據(jù)芯片結(jié)果信號(hào)的強(qiáng)弱判斷同一樣品中兩種不同蛋白的含量是不恰當(dāng)?shù)摹?/p>

針對(duì)生物芯片的固有不足，美國(guó)Luminex公司開(kāi)發(fā)了另一種高通量定量檢測(cè)技術(shù)，英文名稱為flexible?Multi-Analyte?Profiling，簡(jiǎn)稱xMAP。xMAP的檢測(cè)過(guò)程全部在液相完成，因此又稱為液相芯片(liquid?chips)。在xMAP技術(shù)中，首先對(duì)一些塑料微球進(jìn)行顏色編碼，即使用兩種不同的熒光染料將直徑約5.6μm的聚苯乙烯微球染成不同的熒光色，受分辨技術(shù)的限制，最多可以獲得100種經(jīng)熒光編碼的微球。然后將不同BREs通過(guò)化學(xué)方法共價(jià)交聯(lián)在不同顏色的微球上，根據(jù)檢測(cè)的需要將結(jié)合有不同BRE的微球以及TMs的另一種結(jié)合有熒光分子的BREs共同組成檢測(cè)試劑，與待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)之后，將形成編碼微球-TM-熒光報(bào)告分子復(fù)合物。最后利用一種專用的分析儀對(duì)這種微球-TM-熒光報(bào)告分子復(fù)合物進(jìn)行檢測(cè)，分析儀可發(fā)出兩束不同的激光，一束用于激發(fā)熒光報(bào)告分子，根據(jù)熒光強(qiáng)度可以判定微球上結(jié)合的TM的量，另一束激光用于激發(fā)微球上的熒光素，判定是那種微球，根據(jù)預(yù)先確定的微球與BRE的對(duì)應(yīng)關(guān)系，確定是那一種TM。