[發明專利]農桿菌介導的花椒轉基因方法

無效

• 申請號: 200710078066.2
• 申請日: 2007-12-25
• 公開（公告）號: CN101195832A
• 公開（公告）日: 2008-06-11
• 發明（設計）人: 趙德剛;曾曉芳;李巖
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00
• 代理公司: 貴陽東圣專利商標事務有限公司
• 代理人: 袁慶云

1.一種農桿菌介導的花椒轉基因方法，包括下列步驟：

(1)將帶腋芽幼嫩莖段及莖尖接種于誘導培養基中，以萌發20天腋芽的葉柄及莖段作為浸染外植體；

(2)將農桿菌單菌落，用牙簽挑取，加入到YEP液體培養基中培養震蕩培養，直到OD值達到0.4-0.7，離心收集菌體，用WPM重懸培養基重懸制得農桿菌菌液；

(3)將葉柄及莖段切成0.5cm左右的外植體，接種到誘導培養基于黑暗中預培養，培養時間48-72h，投入步驟b農桿菌菌液中，使外植體與農桿菌充分接觸，取出外植體，轉入共培養基上培養48-72h，然后轉入篩選培養基中誘導芽再生，最后將材料接種到生根培養基中誘導生根。

2.如權利要求1所述的農桿菌介導的花椒轉基因方法，包括下列步驟：

(1)材料消毒方法：田間取外植體在流水中沖洗2h，用少量洗衣粉刷洗材料表面，再用流水將洗衣粉充分冼凈，75％酒精表面消毒45s后無菌水沖洗1次再用0.1％升汞消毒7min后無菌水沖洗5次，切取0.5-1cm帶腋芽莖段接種于誘導培養基；

(2)農桿菌的準備：用接種針蘸取-80℃凍存的含有pBin19重組質粒的農桿菌，在YEP固體培養基上劃平板，28℃恒溫培養24-48h至長出合適大小的菌斑；用牙簽挑取農桿菌單菌落加入到5mlYEP液體培養基中，28℃200rpm震蕩培養24h，于5ml菌液中取500ul加入50ml?YEP液體培養基中，28℃200rpm震蕩培養，直到OD值達到0.4～0.7；將菌液轉移到50ml離心管中，6000rpm，4℃離心10min，收集菌體；用WPM重懸培養基重懸離心收集的農桿菌，調節菌液OD值在0.3～0.4之間；

(3)植物材料的農桿菌侵染：取誘導培養20天腋芽葉柄及莖段，切成0.5cm左右的切段，接種到誘導培養基中黑暗中培養48-72h后，投入預先準備好的農桿菌菌液中，不斷搖動，使外植體與農桿菌充分接觸，6～8min后，取出外植體，置于干燥無菌濾紙上吸去多余的菌液，轉入共培養基上，培養48-72h，立刻轉入篩選培養基中誘導愈傷組織的產生；

(4)分化及壯苗：材料轉入篩選培養基后2周可見愈傷組織產生，3個月后愈傷組織再分化出芽，再生的芽4-5周后，小苗長至3-4公分高；

(5)完整植株的獲得：將小苗轉至生根培養基中誘導生根，2周后材料下端長出白色小根，繼續培養即獲得花椒轉基因植株試管苗；

其中：植物組織培養各個階段，除共培養及預培養階段不需要光照外，培養條件為光照強度為2000lx，每日光照16小時，培養溫度(26±2)℃；

生根培養基為1/2WPM培養基，其余培養基均為WPM常規培養基。

3.如權利要求2所述的農桿菌介導的花椒轉基因方法，其中：共培養基中含有0.5mg/L?6-芐氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖，重懸培養基中含有20g/L蔗糖。

4.如權利要求3所述的農桿菌介導的花椒轉基因方法，其中：誘導培養基中含有0.5mg/L-芐氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸及30g/L蔗糖，篩選培養基1中含有0.5mg/L?6-芐氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸、50mg/L卡那霉素、150mg/L頭孢霉素及30g/L蔗糖。

5.如權利要求4所述的農桿菌介導的花椒轉基因方法，其中：1/2WPM生根培養基中含有150mg/L頭孢霉素及20g/L蔗糖。