[發明專利]一種用于檢測高致病性豬藍耳病病毒核苷酸片段的引物和探針序列

有效

• 申請號: 200710076592.5
• 申請日: 2007-08-24
• 公開（公告）號: CN101144108A
• 公開（公告）日: 2008-03-19
• 發明（設計）人: 肖性龍;曾政;張經緯;楊澤林
• 申請（專利權）人: 深圳太太基因工程有限公司;重慶市動物疫病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
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技術領域

本發明涉及一種用于檢測高致病性豬藍耳病病毒核苷酸片段的引物和探針序列。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine?Reproductive?and?Respiratory?syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種豬病毒性疾病。其特征為各種年齡的豬均可感染此病，主要臨床癥狀是發病豬厭食，嗜睡，體溫升高。繁殖母豬受精率低下，妊娠母豬發生早產，晚期流產，死胎，弱胎及木乃伊胎，哺乳母豬泌乳不足，嚴重影響新生豬生長發育和甚至死亡，種公豬表現性功能下降，影響精液質量和精子活力。仔豬和育肥豬表現呼吸系統癥狀，呼吸困難急促，呈間質性肺炎，耳部及趾部皮膚發紺。

高致病性豬藍耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株引起的一種急性高致死性傳染病。仔豬發病率可達100％、死亡率可達50％以上，母豬流產率可達30％以上，育肥豬也可發病死亡是其特征。國外的研究表明，同一基因型的PRRSV分離毒株之間存在明顯的序列差異，特別是在基因組ORFla的nsplb和nsp2，ORF3和ORF5的變異性很大。我國已發現nsp2的變異主要表現在氨基酸的缺失。

PRRSV不同分離株核苷酸序列存在廣泛而明顯的變異，依據血清學試驗及結構基因序列分析結果可將PRRSV劃分為兩種基本的基因型，即歐洲型和美洲型，前者主要流行于歐洲地區，而后者主要流行于美洲和亞太地區。歐洲型的代表株為LV株，美洲型的代表株為VR2332株，兩者的核苷酸序列相似性約為60％。

目前常見的病毒分離和血清學診斷方法，操作繁瑣、耗時、敏感性低、特異性差，不適宜作為病毒的早期診斷。而由于缺乏有效的疫苗，因而及時診斷疾病、及時處理疫情就變得十分重要，這就需要有一種既準確又快速的實驗室檢測方法來確定病原。隨著分子生物學技術的發展，普通PCR方法已經廣泛應用于臨床診斷，但該技術需要對PCR產物進行后處理，極易導致PCR產物污染，同時有-定的非特異性擴增。而熒光PCR技術則是在普通PCR技術的基礎上，在擴增反應體系中加入一對特異性引物的同時再加入一個特異性的熒光探針，使用實時監測的熒光PCR檢測儀來檢測靶核苷酸序列的技術。除了具有普通PCR的優點外，它還具有以下優點：

(1)特異性更強，靈敏度更高。由于多使用了一條可與模板互補配對的熒光探針，提高了特異性，并且由自動化儀器收集熒光信號，避免了人工判斷的主觀性，又可進一步提高靈敏度。(2)全封閉反應，在線式實時監測熒光，無須PCR產物的后處理，避免污染，保證了結果的可靠性。(3)數據分析選在核酸擴增的對數期，擯棄普通PCR方法的受多因素干擾的終點分析法，使得定量更準確可靠。(4)可實現單管雙檢或多檢，還可設計針對性內標，監控抽提效率及排除抑制劑干擾。(5)不接觸有毒試劑，操作安全。(6)有利于規模化、自動化及聯網管理。(7)適用范圍更廣，理論上可檢測任何病毒的核酸。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于檢測高致病性豬藍耳病病毒核苷酸片段的引物和探針序列。

基于上述目的，本發明采用以下技術方案：

1.一種用于檢測高致病性豬藍耳病病毒核苷酸片段的引物對，其特征在于所述的引物對為：由序列為CCCAAGCTGATGACACCTTT的上游引物PVpf和序列為AATCCAGAGGCTCATCCTGGT的下游引物PVpr組成的引物對。

2.一種用于檢測高致病性豬藍耳病病毒核苷酸片段的探針，其特征在于所述的探針PVpb序列為CGCGTAGAACTGTGACAACAACGCTGA。

本發明的具體原理是利用一對靶核苷酸序列的特異性引物和一個特異性熒光探針，采用耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、四種核苷酸單體(dNTP)等成分，并應用PCR技術實現靶核苷酸序列的核酸片段擴增。所使用的探針為兩端分別標記熒光報告基團(R)和熒光淬滅基團(Q)的寡核苷酸。在探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團所吸收，而在PCR擴增過程中，Taq酶的5’端外切酶活性將特異結合在靶核苷酸片段上的熒光探針酶切降解，使熒光報告基團游離于反應體系中，脫離了熒光淬滅基團的屏蔽作用，熒光報告基團的熒光信號就可以由儀器檢測到，熒光信號量的變化與擴增產物量成正比，從而判定待測樣本中靶核苷酸序列的存在。

附圖說明

附圖：利用引物對PVpf/PVpr和探針PVpb檢測高致病性豬藍耳病病毒陽性樣品的熒光PCR擴增圖。

具體實施方式