[發明專利]三重熒光定量RT－PCR檢測A、B和H5亞型流感病毒的引物、探針、試劑盒及方法

無效

• 申請號: 200710075586.8
• 申請日: 2007-08-10
• 公開（公告）號: CN101363063A
• 公開（公告）日: 2009-02-11
• 發明（設計）人: 程小雯;吳春利
• 申請（專利權）人: 程小雯;吳春利
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 深圳市匯力通專利商標代理有限公司
• 代理人: 王鎖林

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種能夠同時檢測A型、B型和H5亞型流感病毒的三重熒光定量RT-PCR技術及其應用。?

背景技術

禽流感病毒(AIV)是由A型流感病毒引起的家禽和野禽的一種烈性傳染病，給養禽業造成巨大損失，我國農業部和國際獸醫局都將其定為A類傳染病。禽流感其病理變化因感染病毒毒株毒力的強弱、病程長短和禽種的不同而不同。其臨床癥狀因感染禽的種類、年齡、性別、并發感染情況及所感染毒株的毒力和其他環境等不同而表現出的癥狀很不一致。自1878年禽流感在意大利爆發和流行到如今已有100多年的歷史。禽流感已成為具有重要公共衛生意義的傳染病，該病不僅具有發生突然、傳播迅速、發病率高、致死率高等特點，而且禽流感病毒是幾乎所有A型流感病毒的基因庫，其自然宿主的廣泛性及遺傳變異給禽流感的及時定性診斷和預防帶來很大困難。由于候鳥的遷徙和國際間禽類貿易的日益頻繁，使得該病呈全球性分布，給養禽業造成巨大的經濟損失。以往認為禽流感病毒對人群無致病力，但1997年“香港H5禽流感、2000年H9、2003年荷蘭H7至2004年亞洲的H5均發生感染人，甚至導致人員死亡，死亡率約30％左右。其危害性比2003年的SARS還大、還難于預料。給整個國民經濟和社會的發展造成了嚴重的影響。長期以來禽流感的診斷一直依賴于病原的分離和鑒定。近年來相繼建立的禽流感瓊脂擴散(AGP)、血凝抑制試驗(HI)、神經氨酸酶抑制試驗(NI)、間接酶聯免疫吸附試驗(ELAISA)等血清學診斷技術及分子診斷技術(RT-PCR)，已經遠遠滿足不了我國禽流感及呼吸道疾病的流行病學監測及現場診斷與防制的迫切需要。?

實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied?Biosystems公司推出，是集PCR擴增技術、探針雜交技術和熒光共振能量轉移光譜技術于一體的新興技術，該技術實現了PCR從定性到定量的飛躍，目前歐美、日本一些國家已廣泛應用。熒光定量PCR技術的原理是指：在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。該方法?是目前國際上用在病毒檢測上最先進的檢測方法之一，具有普通的PCR擴增技術無法比擬的優點：?

1、特異性高。因為只有當探針與待測模板匹配時Taq酶才會啟動其5’-3’端的外切酶活性，將探針上的熒光基團切割下來而產生熒光強度的增長，因此熒光定量PCR技術克服了普通PCR由于非特異性擴增而導致的假陽性問題。?

2、敏感度高。熒光PCR技術可檢出極低拷貝數的核酸，使真正意義上的早期診斷成為現實。?

3、高通量、高效率。1～2小時可全自動同步完成近百個樣品的擴增及檢測，且結果重現性好。?

4、無須凝膠電泳，采用全封閉反應管及光電傳導系統，無管道內污染。?

5、可對DNA和RNA的PCR產物進行定量分析。?

近幾年歐美、日本一些國家也進行RT-PCR和多重熒光定量PCR的研究。國內未見多重熒光定量PCR檢測流感病毒文獻報道。目前國內常用的快速檢測方法為傳統PCR或半巢式-MPCR。上述方法存在一定的缺陷，如傳統PCR或半巢式-MPCR技術易出現假陽性、交叉污染、操作步驟多和費時。而多重熒光定量PCR具有的操作簡單、可定量、污染少、檢測速度快，同時檢測出多個不同型及亞型流感病毒(A型、B型、H5亞型和H9亞型)。檢出病毒的最小量為10^-5TCID50等優點越來越受學者的認同和研究。“多重熒光定量PCR快速檢測流感人(禽)病毒和準確分型”，這一研究不僅在國內屬于首次，而且在國際上也屬于先進水平。在我國流感快速診斷研究方面仍停留在傳統PCR或半巢式-MPCR技術中，這與我國作為流感多發地來說是極不相稱，因此，研究開發多重熒光定量PCR檢測流感病毒技術，為使我國的流感病毒快速診斷技術盡快的與國際接軌，適應當今快速前進社會的發展，確保人們的生命安全和國家的利益具有重要意義。?

發明內容

本發明所要解決的技術問題是：提供一種三重熒光定量RT-PCR檢測A型、B型和H5亞型流感病毒的引物、探針、檢測試劑盒及方法，以使能夠同時檢測A型、B型和H5亞型流感病毒，而且操作簡單、可定量、污染少、檢測速度快。?

為了解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：?

本發明三重熒光定量RT-PCR檢測A型、B型和H5亞型流感病毒的引物及探針，其DAN序列如下：

A型??????上游引物：5’CAGAGACTTGAAGATGTTTTTGC，?