[發明專利]一種用于檢測登革病毒Ⅲ型核苷酸片段的引物和探針序列

有效

• 申請號: 200710074189.9
• 申請日: 2007-05-08
• 公開（公告）號: CN101139638A
• 公開（公告）日: 2008-03-12
• 發明（設計）人: 肖性龍;吳新偉;張經緯;狄飚;伍業健
• 申請（專利權）人: 深圳太太基因工程有限公司;廣州市疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
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技術領域

本發明涉及一種用于檢測登革病毒III型核苷酸片段的引物和探針序列。

背景技術

登革病毒(dengue?virus，DEN)是黃病毒屬的單股正鏈RNA病毒，根據E蛋白的抗原性不同，分為I型、II型、III型和IV型四個血清型。登革病毒以埃及伊蚊和白紋伊蚊為傳播媒介，引起登革熱(classicaldengue?fever，簡稱DF)和登革出血熱/登革休克綜合癥(den-gue?hemorrhagi?fever/dengue?shocksyndrome，簡稱DHF/DSS)。每年全世界熱帶與亞熱帶地區有1億人感染登革病毒，其中以與我國接壤的東南亞地區流行最為嚴重(WHO.1998)。20世紀，登革熱在世界各地發生過多次大流行，病例數百萬計，在東南亞一直呈地方性流行。我國廣東于1978年發生流行，并分離出第IV型登革病毒。此后，于1979、1980、1985年小流行中分離出I、II、III型病毒。近年來，我國南方頻發登革熱的流行，時有DHF/DSS的病例報告。DHF/DSS表現為高熱，出血，休克，病死率較高，但其發生機制不明，多數學者認為DHF/DSS的發生受病毒本身的生物特性和病人的免疫因素兩方面的影響。近年來，隨著人口流動的增加，城市化的發展，登革病毒型別的地域性分布被破壞，DF的流行區域擴大，DHF/DSS病例亦有增多的趨勢。目前這一疾病已成為熱帶與亞熱帶地區的一個嚴重公共衛生問題。由于缺乏有效的疫苗，因而及時診斷疾病、及時處理疫情就變得十分重要，這就需要有一種既準確又快速的實驗室檢測方法來確定病原.這也是臨床診斷與流行病學研究的一個必不可少的環節。

登革病毒的實驗室診斷，國內外都已建立了一整套成熟的技術，傳統的方法主要有血凝抑制試驗、補體結合試驗、中和試驗等，這些方法都不同程度地存在著敏感性低、特異性差、操作繁瑣、耗時等不足，尤其是難以準確分型。隨著登革病毒單克隆抗體的研制成功，基于登革病毒型特異性單克隆抗體的分型鑒定方法，如間接免疫熒光技術(IFA)、酶聯免疫吸附技術(ELIA)廣泛應用于全球各個登革病毒檢測實驗室，登革病毒的準確分型問題得到解決，但所有這些技術，仍不可避免地存在著實驗耗時的問題，因為這些方法都是建立在病毒分離培養的基礎上，不適宜作為登革熱的早期診斷。

隨著分子生物學技術的發展，普通PCR方法已經廣泛應用于臨床診斷，但該技術需要對PCR產物進行后處理，極易導致PCR產物污染，同時有一定的非特異性擴增。而熒光PCR技術則是在普通PCR技術的基礎上，在擴增反應體系中加入一對特異性引物的同時再加入一個特異性的熒光探針，使用實時監測的熒光PCR檢測儀來檢測靶核苷酸序列的技術。除了具有普通PCR的優點外，它還具有以下優點：

(1)特異性更強，靈敏度更高。由于多使用了一條可與模板互補配對的熒光探針，提高了特異性，并且由自動化儀器收集熒光信號，避免了人工判斷的主觀性，又可進一步提高靈敏度。(2)全封閉反應，在線式實時監測熒光，無須PCR產物的后處理，避免污染，保證了結果的可靠性。(3)數據分析選在核酸擴增的對數期，擯棄普通PCR方法的受多因素干擾的終點分析法，使得定量更準確可靠。(4)可實現單管雙檢或多檢，還可設計針對性內標，監控抽提效率及排除抑制劑干擾。(5)不接觸有毒試劑，操作安全。(6)有利于規模化、自動化及聯網管理。(7)適用范圍更廣，理論上可檢測任何病毒的核酸。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于檢測登革病毒III型核苷酸片段的引物和探針序列。

基于上述目的，本發明采用以下技術方案：

用于檢測登革病毒III型核苷酸片段的引物和探針序列包括：由上游引物DenIII?pf序列為GGAAAACCGTCTATCAATATGCTG和下游引物Den?III?pr序列為TCCTCTTGAGAATCTCTTCGCC組成的引物對和探針Den?III?pb序列為CGCGTGAGAAACCGTGTGTCAACTG。