[發(fā)明專利]一種高效生產(chǎn)腺病毒的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710073190.X
• 申請(qǐng)日: 2007-01-31
• 公開（公告）號(hào): CN101235365A
• 公開（公告）日: 2008-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 董艷榮;郭衛(wèi)華;石志斌;黃偉東;彭忞;曾小平;敖然;秦華;周向軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳市清華源興生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N7/00
• 分類號(hào): C12N7/00;C12N15/861;A61K48/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物制藥工藝領(lǐng)域、特別是涉及一種生產(chǎn)重組腺病毒的方法。

背景技術(shù)

隨著2004年世界上第一個(gè)基因治療產(chǎn)品今又生的上市，基因治療越來越得到人們的認(rèn)可。腺病毒是基因治療中常用的基因病毒載體，它的優(yōu)點(diǎn)在于轉(zhuǎn)染效率高、可操作性好、能攜帶較大的目的基因片段、可制備高效價(jià)的病毒顆粒，易于工業(yè)化生產(chǎn)，既能感染分裂期細(xì)胞也可感染非分裂期細(xì)胞，具有安全、致病性低等優(yōu)點(diǎn)。故生產(chǎn)出符合臨床用藥要求的高質(zhì)量而且大量的腺病毒就非常重要。

傳統(tǒng)上大量生產(chǎn)腺病毒的方法是組織培養(yǎng)瓶或“細(xì)胞工廠”方式生長(zhǎng)。收獲病毒感染的細(xì)胞并使之凍融，以細(xì)胞粗制裂解液的形式從細(xì)胞中釋放出病毒。該傳統(tǒng)方法不能生產(chǎn)大量所需的病毒。

2004年上市的今又生和張樹元采用的方法相似，均是采用cellcube系統(tǒng)(灌流細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng))。即病毒感染宿主細(xì)胞后，通過收集并裂解細(xì)胞的方法收獲病毒。

美國(guó)專利6,485,958公布了收集病毒上清及對(duì)所收獲上清的純化方法。具體為1、生產(chǎn)重組腺病毒的方法，這個(gè)方法包括將腺病毒DNA導(dǎo)入包裹細(xì)胞，收獲上清。2、至少50％的腺病毒釋放到上清中。3、至少70％的腺病毒釋放到上清中。4、至少90％的腺病毒釋放到上清中，等等。實(shí)施例中分別列舉了收獲病毒上清和收獲細(xì)胞的方法。實(shí)施例3為病毒感染后40-72小時(shí)收獲細(xì)胞，通過3-6次反復(fù)凍融裂解細(xì)胞。實(shí)施例4為感染后培養(yǎng)8-12天收集病毒上清。

美國(guó)專利6,905,862采用了收獲病毒培養(yǎng)上清和收集細(xì)胞并破碎這兩種方法。但是沒有對(duì)收獲病毒上清的培養(yǎng)方法進(jìn)行具體說明。該專利保護(hù)的是：1：從生物培養(yǎng)基中純化腺病毒的方法步驟，包括：得到含腺病毒的生物培養(yǎng)基；離子交換；得率至少為病毒顆粒的70％；2：1中的腺病毒為重組腺病毒；3：2中的生物培養(yǎng)基為生產(chǎn)腺病毒的細(xì)胞的上清；4：2中的生物培養(yǎng)基為生產(chǎn)腺病毒的細(xì)胞的裂解物；等等。

上述方法均沒有對(duì)具體的培養(yǎng)方法進(jìn)行說明。同時(shí)通過收集細(xì)胞并破碎的懸浮方法來生產(chǎn)腺病毒有以下缺點(diǎn)：細(xì)胞破碎時(shí)容易產(chǎn)生浮質(zhì)，對(duì)能在空氣中傳播的病毒，容易污染；細(xì)胞破碎時(shí)容易使介質(zhì)中存在大量細(xì)胞碎片，使純化更加復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本發(fā)明提供一種可大規(guī)模生產(chǎn)腺病毒的生產(chǎn)方法。該方法包括：

a)接種宿主細(xì)胞，使細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；

接種宿主細(xì)胞于生物反應(yīng)器中，接種密度為1-5×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml，進(jìn)行灌流培養(yǎng)。

b)置換生物反應(yīng)器罐體內(nèi)的培養(yǎng)液，用腺病毒感染所述宿主細(xì)胞，病毒繁殖；

當(dāng)生物反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞量達(dá)到5×10⁶-3×10⁷個(gè)/ml時(shí)，用病毒培養(yǎng)液置換生物反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)液，然后接種病毒，并使病毒在生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行繁殖。當(dāng)葡萄糖濃度下降至1.0-1.5g/l時(shí)開始灌流，維持生物反應(yīng)器罐體內(nèi)葡萄糖濃度為0.1-1.6g/l。

c)收集病毒懸液。

通過監(jiān)測(cè)生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液中病毒濃度，當(dāng)病毒濃度達(dá)到1×10¹⁰vp/ml時(shí)收集病毒懸液。

d)濃縮病毒上清。

將收獲的病毒上清進(jìn)行超濾濃縮。

還包括用層析將腺病毒從所述濃縮液中分離出來。

腺病毒生產(chǎn)過程中所用的培養(yǎng)基，接種密度，細(xì)胞感染密度，病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)，載體類型和感染時(shí)間都影響腺病毒的產(chǎn)量。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM+2-10％的血清，血清濃度優(yōu)選為5-10％。病毒培養(yǎng)液為DMEM+0.01-2％的血清。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的病毒感染宿主細(xì)胞的MOI為5-50，優(yōu)選為5-25。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明中當(dāng)生物反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞量達(dá)到5×10⁶-3×10⁷個(gè)/ml時(shí)感染病毒。

根據(jù)上述方案，本發(fā)明的宿主細(xì)胞是能包裝重組腺病毒的細(xì)胞，優(yōu)選為HEK293、A594、PER.C6細(xì)胞等。更優(yōu)選的HEK293細(xì)胞是人胚腎細(xì)胞，整合了Ad5左端12％的基因組，含有Ad5E1區(qū)。

本發(fā)明的腺病毒可以是人腺病毒，優(yōu)選為Ad5，Ad2，Ad6，Ad35。也可以是動(dòng)物腺病毒。本發(fā)明的腺病毒是包含編碼外源基因的重組腺病毒。包括用于基因治療的重組腺病毒和用于疫苗的腺病毒載體。

本發(fā)明采用當(dāng)病毒濃度達(dá)到1×10¹⁰vp/ml時(shí)收集病毒。