[發明專利]血清替代劑及無血清虹鱒胚胎細胞系培養基

無效

• 申請號: 200710072726.6
• 申請日: 2007-08-31
• 公開（公告）號: CN101126077A
• 公開（公告）日: 2008-02-20
• 發明（設計）人: 薛淑群;尹洪濱
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黑龍江水產研究所
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所
• 代理人: 單軍

技術領域

本發明涉及一種血清替代劑及無血清胚胎細胞系培養基。

背景技術

體外培養細胞所使用的合成培養基需要添加一些天然成分，其中主要添加的天然成分是血清，尤其是牛血清。但在培養基中使用血清存在以下缺陷：1.血清成本高：500mL牛血清價格為3000～4000元；2.活體采集不人道；3.血清質量不穩定，各批次間存在差異，影響實驗數據的穩定性；4.血清所含成分復雜，其中某些物質對某些細胞的生長有抑制作用，影響細胞生長和細胞某些功能的表達，對某些細胞的體外培養有去分化作用；5.血清中大量、復雜的蛋白質給疫苗、細胞因子、單克隆抗體等細胞產品的分離純化帶來很大困難；6.后期各種細胞產物提純和鑒定過程復雜；7.可能引起異種血清的過敏反應。

而且目前沒有適合于虹鱒的無血清胚胎細胞系培養基。

發明內容

本發明的目的是為了解決培養基中使用血清成本高，不人道，質量不穩定，某些物質影響細胞生長和細胞某些功能的表達，細胞產品分離純化難度大，后期各種細胞產物提純和鑒定過程復雜，可能引起異種血清的過敏反應及目前沒有適合虹鱒的無血清胚胎細胞系培養基的問題，而提供的一種血清替代劑及無血清虹鱒胚胎細胞系培養基。

血清替代劑由0.3g重組人胰島素樣生長因子-1、0.5g重組人堿性成纖維細胞生長因子、0.65g血小板源性生長因子B、1.5g牛血清白蛋白、5g牛轉鐵蛋白、34gβ-巰基乙醇、0.294g谷氨酸、0.110g丙酮酸鈉和2～3g非必需氨基酸組成。

用上述血清替代劑配制的無血清虹鱒胚胎細胞系培養基由RPMI-1640培養基和上述血清替代劑組成；每1000mL無血清虹鱒胚胎細胞系培養基中含有上述血清替代劑44.354～45.354g，余量為RPMI-1640培養基。

本發明血清替代劑的價格低廉，僅為牛血清的60％。本發明血清替代劑成分少而確定，使用安全性高，質量穩定、產品個批次間無差異，不影響試驗數據的準確性。本發明血清替代劑對細胞的生長無毒、無抑制作用，不影響細胞的生長和功能的表達。因為本發明血清替代劑成分確定，便于后期各種細胞產物提純和鑒定。本發明血清替代劑無動物源性，可避免細胞過敏反應。

本發明無血清虹鱒胚胎細胞系培養基培養虹鱒胚胎細胞系具有增殖速度快，凋亡率低，安全穩定，傳代時間長的優點。

附圖說明

圖1是具體實施方式三中第29代虹鱒胚胎細胞在400×相差顯微鏡下的觀察圖，圖2是具體實施方式三中第6代虹鱒胚胎細胞染色體中期分裂相觀察圖，圖3是具體實施方式三中第6代虹鱒胚胎細胞染色體組型圖，圖4是具體實施方式三中第29代虹鱒胚胎細胞染色體中期分裂相觀察圖，圖5是具體實施方式三中第29代虹鱒胚胎細胞中期染色體組型圖。

具體實施方式

具體實施方式一：本實施方式血清替代劑由0.3g重組人胰島素樣生長因子-1(rhIGF-1)、0.5g重組人堿性成纖維細胞生長因子(rh-bFGF)、0.65g血小板源性生長因子B(PDGF-B)、1.5g牛血清白蛋白(BSA)、5g牛轉鐵蛋白、34gβ-巰基乙醇、0.294g谷氨酸、0.110g丙酮酸鈉和2～3g非必需氨基酸組成。

本實施方式血清替代劑適用范圍廣，可用于魚類動物細胞無血清培養。本實施方式中的非必需氨基酸購自于上海微科生化試劑有限公司，其中不含有谷氨酸。本實施方式血清替代劑中不含有膽固醇。

具體實施方式二：本實施方式無血清虹鱒胚胎細胞系培養基由RPMI-1640培養基和具體實施方式一所述血清替代劑組成；每1000mL無血清虹鱒胚胎細胞系培養基中含有具體實施方式所述血清替代劑44.354～45.354g，余量為RPMI-1640培養基。

具體實施方式三：本實施方式虹鱒胚胎細胞系培養方法：

一、虹鱒胚胎的收集

本實施方式虹鱒魚胚胎取自中國水產科學研究院黑龍江水產研究所渤海冷水性魚實驗站的優質虹鱒受精卵。

二、胚胎(囊胚-原腸后期)細胞分離

收集到的虹鱒胚胎鏡檢合格后在18℃條件下培養至囊胚后期或原腸后期，然后將虹鱒胚胎放在1×PBS溶液中反復浸洗3～4次，再用濃度為70％酒精浸泡消毒滅菌，之后用pH值為7.4的1×PBS溶液清洗三次，再放到RPMI-1640完全培養基中用尖頭鑷子剝除卵膜分離出細胞團，并用RPMI-1640完全培養基重懸分離出的胚胎細胞。

本實施方式RPMI-1640完全培養基購自于美國Gibco公司。

三、虹鱒胚胎細胞的原代和傳代培養