[發明專利]用離子液體結晶蛋白質的方法

有效

• 申請號: 200710072352.8
• 申請日: 2007-06-13
• 公開（公告）號: CN101092445A
• 公開（公告）日: 2007-12-26
• 發明（設計）人: 張密林;徐曉冬;李欣欣;丹媛媛;景曉燕
• 申請（專利權）人: 哈爾濱工程大學
• 主分類號: C07K1/30
• 分類號: C07K1/30;C07K1/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

(一)技術領域

本發明涉及的是一種蛋白質結晶的新方法，特別是涉及一種將離子液體用于蛋白質結晶的新方法。

(二)背景技術

近年來，由于生物活性物質在醫學、藥學、化學、農業和工業方面的廣泛應用，因此通過X射線晶體學揭示生物大分子結構與功能之間關系而顯得尤為重要。以晶體形式存在的生物大分子是比較穩定的，而X射線衍射是確定晶體分子三維空間結構最可靠的方法。具體了解生物大分子結構對于新藥設計、蛋白質工程以及改變分子結構或構象等方面都具有十分重要的意義。但是從總體方面來說，生物大分子的晶體培養仍然是摸索性和經驗性的，在某種程度上還要靠機遇。晶體培養已成為當前阻礙提高晶體結構分析速度的關鍵性問題。

專利申請號為97192855.X的專利申請文件中公開了一種從蛋白質溶液結晶蛋白質的方法，該方法包括：(a)用包含硫原子的鹽處理蛋白質溶液，所說的硫原子具有低于6的氧化態；(b)以結晶形式回收蛋白質。本發明的特點在于將離子液體用于蛋白質的結晶。近年來，離子液體已經被廣泛應用于生物領域。例如：由于其電化學穩定性高，具有較高的電導率和較寬的電化學窗口，人們已成功的利用離子液體來分離純化蛋白質。并且有研究表明，某些蛋白質在離子液體中的活性和穩定性大大提高。一些蛋白質在水中的溶解度較小，很難得到符合X射線的晶體，而離子液體對很多無機和有機物質都表現出良好的溶解能力，這就為這類蛋白質的結晶提供了可能。此外，離子液體的結構具有更大的可設計性，即可通過修飾或調變陰陽離子的結構或種類來調控離子液體的物理化學性質，以滿足特定的應用需求。由于離子液體的低揮發性，使蛋白質分子緩慢的從溶液中析出而結晶，避免了多晶的生成。而且所培養的蛋白質晶體與不加離子液體比較衍射強度高，重復性好。

(三)發明內容

本發明的目的在于提供一種將離子液體用于蛋白質結晶并使其處于一種可控狀態的用離子液體結晶蛋白質的方法。

本發明的目的是這樣實現的：用離子液體-水混合溶液從蛋白質溶液中結晶蛋白質，所述的離子液體-水混合溶液是由重量比為離子液體1～85％與沉淀劑1～25％加緩沖溶液配制而成的pH值為4.0～11.0的混合液。

所述的離子液體為咪唑類離子液體、硝基乙胺類離子液體、胍類離子液體、季銨類離子液體、季鏻類離子液體或吡啶類離子液體中的一種，其重量比含量優選5～50％。

所述的沉淀劑是氯化鈉、氯化鎂、硫酸鈉、醋酸銨、檸檬酸銨、硝酸銨、硫酸銨、硫酸鈣、硫酸鎂、硝酸鉀、硼酸鉀、磷酸鉀、酒石酸鉀、酒石酸鉀鈉、檸檬酸鈉、碘化鈉、硝酸鈉、磷酸鈉、氯化鋰或硫酸鋰中的一種，其重量比濃度優選3～6％。

所述緩沖溶液pH值優選4.4～10.5。

采用本發明的蛋白質結晶新方法，將濃度為10～300mg/mL的蛋白質溶液添加至離子液體-水混合溶液中，進行蛋白質結晶。

采用本發明的蛋白質結晶新方法進行蛋白質結晶，可以在0℃～50℃條件下獲得蛋白質晶體。

采用本發明的蛋白質結晶新方法進行蛋白質結晶，可以使工藝條件變得寬泛，而且在不同條件下可獲得不同形貌的蛋白質單晶，所培養的蛋白質晶體衍射強度高，重復性好，提高了結晶過程的可操作性。

采用本發明的蛋白質結晶新方法，可以獲得動物蛋白質晶體，如蛋清溶菌酶；也可以獲得植物蛋白質晶體，如索馬甜蛋白。

采用本發明的蛋白質結晶新方法，既可以從配制的蛋白質溶液中獲得蛋白質單晶，也可以直接從蛋白質粗原料中結晶蛋白質。

(四)附圖說明

圖1為比較例中不加離子液體時，以氯化鈉為沉淀劑，濃度4％(重量)，采用懸滴結晶法，醋酸-醋酸鈉緩沖體系下，pH值4.5時所得蛋清溶菌酶晶體圖。

圖2為本發明中以氯化鈉為沉淀劑，濃度3％(重量)，采用懸滴結晶法，醋酸-醋酸鈉緩沖體系下，pH值4.4，四氟硼酸丁基甲基咪唑與緩沖溶液體積比為1∶6時所得蛋清溶菌酶晶體圖。

圖3為本發明中以氯化鈉為沉淀劑，濃度3％(重量)，采用懸滴結晶法，醋酸-醋酸鈉緩沖體系下，pH值4.6，四氟硼酸丁基甲基咪唑與緩沖溶液體積比為1∶6時所得蛋清溶菌酶晶體圖。

圖4為本發明中以氯化鈉為沉淀劑，濃度3％(重量)，采用懸滴結晶法，醋酸-醋酸鈉緩沖體系下，pH值4.6，四氟硼酸丁基甲基咪唑與緩沖溶液體積比為5∶9時所得蛋清溶菌酶晶體圖。

圖5為本發明中以硫酸鈉為沉淀劑，濃度4％(重量)，采用懸滴結晶法，醋酸-醋酸鈉緩沖體系下，pH值4.5，四氟硼酸丁基甲基咪唑與緩沖溶液體積比為5∶9時所得蛋清溶菌酶晶體圖。