[發明專利]用于定量檢測硫酸鹽功能菌的引物及熒光探針

無效

• 申請號: 200710072334.X
• 申請日: 2007-06-08
• 公開（公告）號: CN101086022A
• 公開（公告）日: 2007-12-12
• 發明（設計）人: 馬放;魏利;李維國
• 申請（專利權）人: 哈爾濱工業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N33/52
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所
• 代理人: 榮玲

技術領域

本發明涉及用于硫酸鹽功能菌定量檢測的引物及探針。

背景技術

硫酸鹽還原功能菌是一類與硫酸鹽還原反應相關的細菌的總稱，是一個基于功能角度的對微生物的分類，在油田生產的過程中，硫酸鹽還原功能菌的繁殖會造成很多危害，如：地面系統中腐蝕產物-不溶于水的金屬硫化物，導致污水發黑、懸浮固體含量增加，使處理后水中懸浮固體含量超標；硫酸鹽還原功能菌的快速定量檢測，對于油田水質檢測和地面系統中合理殺菌濃度的確定，及時指導生產實踐具有重要的意義。目前，油田系統內硫酸鹽功能菌菌的計數主要執行中國石油天然氣行業標準，“油田注入水細菌分析方法-絕跡稀釋法”(部頒標準)、SY-T0532-93。上述的這種方法存在的問題是：檢測需要14天的時間，由于檢測周期較長，不能有效的和即時的指導生產實踐，在實際操作過程中有些嚴格的厭氧硫酸鹽功能菌無法生存，導致硫酸鹽功能菌的記數結果不準確，不能真實的反映生產實際情況，檢測結果無意義，同時檢測費用較高。

發明內容

本發明是為了解決現有的油田水質SRB菌檢測周期長、不能真實全面的反應水中的SRB菌的數量、不能即時的指導生產、檢測費用較高的問題，而提供一種用于定量檢測硫酸鹽功能菌的引物及熒光探針。用于定量檢測硫酸鹽功能菌的引物：上游引物：5’-TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT-3’，下游引物：5’-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-3’。用于定量檢測硫酸鹽功能菌的熒光探針為FAM：5’-CAACGAGCGCAACC-3’MGB；Tag?Man-MGB探針的5’端標記的報告熒光基團為FAM，3’端標記的淬滅熒光基團為TAMRA-MGB。本發明采用Tag?Man-MGB探針，通過收集具有硫酸鹽鹽還原功能菌株的16SrDNA基因序列，設計一對保守的特意性引物和一條特意的MGB探針，能夠準確的診斷，記數結果準確、有效的縮短計數時間，從樣本DNA提取到熒光定量PCR最后獲得檢測結果僅僅需要6個小時、能真實的反映生產實際情況，減少檢測成本。

附圖說明

圖1是具體實施方式三中以pGEM-T-SRB為底物的擴增曲線，其中①為1.496×10⁷、②為1.496×10⁶、③為1.496×10⁵、④為1.496×10⁴、⑤為1.496×10³、⑥為1.496×10²、⑦為水對照；圖2是具體實施方式三中硫酸鹽還原菌熒光定量檢測標準曲線圖。

具體實施方式

具體實施方式一：本實施方式中用于定量檢測硫酸鹽功能菌的引物：上游引物：5’-TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT-3’，下游引物：5’-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-3’。

具體實施方式二：本實施方式中用于定量檢測硫酸鹽功能菌的熒光探針為FAM：5’-CAACGAGCGCAACC-3’MGB；Tag?Man-MGB探針的5’端標記的報告熒光基團為FAM，3’端標記的淬滅熒光基團為TAMRA-MGB。

具體實施方式三：本實施方式具體說明本發明是如何實施的，本實施方式通過以下步驟實現：

一、設計引物和探針：

采用Tag?Man-MGB探針，通過收集具有硫酸鹽鹽還原功能菌株的16SrDNA基因序列，設計一對保守的特意性引物和一條特意的MGB探針。

上游引物(Forward?Primer)為：5’-TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT-3’；

下游引物(Reverse?Primer)為：5’-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-3’

熒光探針為FAM5’-CAACGAGCGCAACC-3’MGB；熒光定量檢測硫酸鹽功能菌的探針(Tag?Man-MGB探針)的5’端標記的報告熒光基團FAM，3’端標記的淬滅熒光基團TAMRA-MGB。

引物和探針由生物工程公司完成。

二、操作方法：

A、核酸DNA的提取：1)將1mL污泥震蕩5min，然后3000轉離心，留上清液；2)加入2倍體積的10×PBS進行洗滌，震蕩5min，然后12000轉離心5min，去掉上清液；3)加入10×PBS緩沖液100μl，然后超聲40s；4)用華舜DNA小量細菌提取試劑盒進行后續的DNA提取。

B、real?time?PCR標準品的制備：